溞類急性毒性試驗中陽性參比毒物的篩選

郁斯貽 朱夢杰 湯琳

摘要 以硫酸鋅、硫酸鎘和苯酚作為受試毒物，以大型溞為受試生物，開展了急性毒性試驗中陽性參比毒物的篩選試驗，測定了反應(yīng)24和48 h后各濃度參比毒物中大型溞的抑制率，確定硫酸鋅和硫酸鎘可作為大型溞急性毒性試驗的陽性參比毒物。硫酸鋅的24 hEC50和48 hEC50分別為3.936和2.782 mg/L，硫酸鎘的24 hEC50和48 hEC50分別為0.745和0.356 mg/L，為今后溞類毒性試驗的開展提供參考和依據(jù)。

關(guān)鍵詞 溞類;參比毒物;毒性試驗

中圖分類號 X83文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）19-0091-02doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.19.026

Abstract Using zinc sulfate， cadmium sulfate and phenol as test toxic substances， Daphnia magna was selected as subjects test organism to conduct a screening study on positive reference? toxic substances in acute toxicity test. The inhibition rates of test toxic substances? at each concentration level to D. magna after 24 and 48 hours were recorded. And the results showed zinc sulfate and cadmium sulfate could be used as positive reference toxic substances for the acute toxicity tests of daphnia. 24 h EC50 and 48 h EC50 of zinc sulfate to D. magna were 3.936 and 2.782 mg/L respectively. 24 h EC50 and 48 h EC50 of cadmium sulfate to D. magna were 0.745 and 0.356 mg/L respectively. This research provided reference and basis for conducting the? toxicity tests of daphnia in the future.

Key words Daphnia;Reference toxic substance;Toxicity tests

隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，環(huán)境問題也日益突出，搬遷或廢棄的工業(yè)、農(nóng)業(yè)污染場地數(shù)量呈現(xiàn)不斷上升的趨勢[1-2]。這些遺留的場地存在較為嚴(yán)重的污染隱患，若不進(jìn)行有效的管理和修復(fù)，它們將會對土壤、地表水、地下水和周邊的環(huán)境造成危害。目前的場地污染調(diào)查以化學(xué)分析為主，但化學(xué)方法較難直觀、全面地反映各類有毒有害物質(zhì)對環(huán)境或生物體的綜合影響。生物毒性試驗可以彌補(bǔ)這方面的不足，能夠直觀地反映污染場地的綜合生態(tài)毒性，監(jiān)測復(fù)雜污染物對環(huán)境所產(chǎn)生的綜合效應(yīng)[3-4]，為進(jìn)一步的場地污染風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)支持。

溞類是甲殼動物枝角類的統(tǒng)稱，隸屬節(jié)肢動物門，體短，呈卵圓形，左右側(cè)扁。溞類在淡水中分布較廣，在海水中也有少量的分布。溞類具有繁殖速度快、生活周期短、來源廣、易培養(yǎng)等特點(diǎn)，且對毒性物質(zhì)敏感，因而很多國家使用溞類開展生物毒性研究[5]。Biesinger等[6]對無機(jī)汞和有機(jī)汞對大型溞的慢性毒性進(jìn)行了研究。潘力軍等[7]使用大型溞對工業(yè)廢水和生活污水開展毒性監(jiān)測。楊燦等[8]研究了氯霉素對溞類的急性和慢性毒性效應(yīng)。

在農(nóng)業(yè)和工業(yè)場地調(diào)查方面，目前也已經(jīng)有一些學(xué)者開展了相關(guān)的生物毒性試驗。但是，國內(nèi)外有關(guān)溞類毒性實驗中質(zhì)控實驗所選用的參比毒物報道很少。ISO 6341：2012《水質(zhì)—大型水蚤（甲殼綱、枝角目）活動抑制的測定》中以重鉻酸鉀為參比毒物，規(guī)定其24 h EC50為0.6～2.1 mg/L[9]。國內(nèi)有許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)僅僅使用重鉻酸鉀測定溞敏感性的方法過于簡單，且實際測定出的24 h EC50值偏小[10]。參比毒物是生物毒性試驗中重要的質(zhì)控措施 ，因此對溞類參比毒物的篩選研究是非常有必要的。

筆者對硫酸鋅、硫酸鎘和苯酚3種毒性物質(zhì)開展了溞類急性毒性試驗，并對這3種物質(zhì)是否可作為溞類毒性試驗的陽性參比毒物進(jìn)行了研究，旨在為今后的農(nóng)用地和工業(yè)用地場地調(diào)查中溞類毒性試驗的開展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

受試生物大型溞（Daphnia magna），購自中國科學(xué)院武漢水生生物所淡水庫，經(jīng)筆者所在實驗室保種培養(yǎng)，表觀健康。急性毒性試驗所用的大型溞是經(jīng)實驗室培養(yǎng)的同一健康親溞孤雌生殖3代以上的幼溞，溞齡不超過24 h，幼溞個體健康、體型均勻。試驗使用經(jīng)曝氣的自來水對大型溞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每天滴加少量小球藻補(bǔ)充餌料。母溞的培養(yǎng)時間為7～10 d，培養(yǎng)溫度為18～22 ℃，光暗比為10? h∶14? h，光照強(qiáng)度為1 000～1 500 lx。急性毒性試驗期間不進(jìn)行喂食。

小球藻（Chlorella vulgaris），購自中國科學(xué)院武漢水生生物所淡水庫，在保種培養(yǎng)期間用于喂食大型溞。

試驗所用的參比毒物硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）、硫酸鎘（CdSO4·8/3H2O）、苯酚（C6H5OH）、乙醇均購自中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為分析純。

主要儀器為光照培養(yǎng)箱（BIC-400），為上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品等。

1.2 試驗方法

1.2.1 大型溞的培養(yǎng)方法。

將購置的懷卵大型溞在室溫下（18～22? ℃）置于500 mL經(jīng)曝氣的自來水中進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每天滴加少量小球藻補(bǔ)充餌料。母溞的培養(yǎng)時間為7～10 d，在自然光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)。第1代幼溞轉(zhuǎn)移至1 000 mL經(jīng)曝氣的水中繼續(xù)培養(yǎng)，以獲得純種的第2代幼溞。將第2代幼溞轉(zhuǎn)移至2 000 mL經(jīng)曝氣的水中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得純種的第3代幼溞作為試驗用溞。第1代和第2代幼溞的培養(yǎng)條件均同母溞。

1.2.2 參比毒物的配制。

選用硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）、硫酸鎘（CdSO4·8/3H2O）、苯酚（C6H5OH）作為參比毒物。以無菌水為溶劑，配制濃度10? g/L的硫酸鋅和硫酸鎘溶液母液以及濃度1 g/L的苯酚溶液母液。由于苯酚在常溫條件下溶解度小，因而在配制苯酚溶液時添加少量的無水乙醇作為助溶劑。在進(jìn)行預(yù)試驗和正式的急性毒性試驗時，可根據(jù)試驗需求將配制好的母液稀釋至一定濃度后使用。

1.2.3 預(yù)試驗。

在進(jìn)行溞類急性毒性試驗前，先做預(yù)試驗，設(shè)置間隔較大的4個濃度，從而確定正式急性毒性試驗各參比毒物的濃度范圍。預(yù)試驗設(shè)置的4個濃度分別為100.0、100、10、0.1 mg/L，同時設(shè)置空白對照，苯酚組增設(shè)助溶劑對照，其助溶劑用量同最高濃度組（100 mg/L）。每種參比毒物每個濃度的燒杯中放入5只經(jīng)實驗室培養(yǎng)的幼溞，不設(shè)置平行組。預(yù)試驗在室溫（18～22 ℃）、自然光照條件下進(jìn)行。試驗期間不進(jìn)行喂食和更換試驗溶液。試驗開始后24和48 h，分別觀察并記錄大型溞的活動抑制情況。

1.2.4 急性毒性試驗。

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，在各參比毒物對大型溞急性活動完全不抑制的最高濃度和100%完全抑制的最低濃度范圍內(nèi)以幾何級數(shù)設(shè)置濃度系列，同時設(shè)置空白對照。每個濃度設(shè)置4組平行，每組試驗燒杯中放入5只幼溞。試驗條件和方法同“1.2.3”。試驗開始后24和48 h分別觀察并記錄大型溞的活動抑制情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)試驗結(jié)果

由表1可知，ZnSO4·7H2O在24和48 h內(nèi)對大型溞無活動抑制（24 h EC0、48 h EC0）的最高濃度均為1 mg/L，100%活動抑制（24 h EC100、48 h EC100）的最低濃度均為10 mg/L。CdSO4·8/3H2O對大型溞24 h EC0、48 h EC0的最高濃度均為0.1 mg/L，24 h EC100、48 h EC100的最低濃度分別為10和1 mg/L。C6H5OH對大型溞24 h EC0、48 h EC0的最高濃度均為10? mg/L，24 h EC100、48 h EC100的最低濃度均為100? mg/L。

2.2 急性毒性試驗結(jié)果

急性毒性試驗結(jié)果見表2。采用SPSS Stastistics 17.0中的Logit模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行概率單位回歸分析。以各參比毒物試驗濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，繪制回歸曲線，得到線性回歸方程y=Bx+A、皮爾遜擬合優(yōu)度卡方檢驗顯著水平、24 h EC50、48 h EC50和95%置信區(qū)間?；貧w分析結(jié)果見表3。

由表3可知，ZnSO4·7H2O和CdSO4·8/3H2O 24 h和48 h的皮爾遜擬合優(yōu)度卡方檢驗的P值均大于0.05，說明這2種參比毒物的試驗數(shù)據(jù)擬合度較好，且ZnSO4·7H2O和CdSO4·8/3H2O具有方便易得、性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，因而是大型溞急性毒性試驗較為理想的陽性參比毒物。C6H5OH 48 h數(shù)據(jù)組的皮爾遜擬合優(yōu)度卡方檢驗的P值小于0.05，說明苯酚的試驗數(shù)據(jù)擬合度較差，且苯酚在常溫條件下微溶于水，實際操作時需添加少量乙醇作為助溶劑，操作較為復(fù)雜，因而不宜作為陽性參比毒物。

3 討論與結(jié)論

該試驗是以大型溞作為受試生物開展的急性毒性試驗，試驗結(jié)果僅適用于大型溞。在實際開展溞類毒性試驗時，還可以選用蚤狀溞、隆線溞等對毒性物質(zhì)敏感的其他溞種。由于不同品種的溞類對各毒物的敏感性不盡相同，所以在選擇其他品種的溞類作為受試生物開展研究時，需要進(jìn)一步驗證硫酸鋅和硫酸鎘是否適合作為其陽性參比毒物。

硫酸鋅、硫酸鎘是實驗室較為常見的化學(xué)品，具有性質(zhì)穩(wěn)定、方便易得的特點(diǎn)。經(jīng)大型溞急性毒性試驗發(fā)現(xiàn)，ZnSO4·7H2O、CdSO4·8/3H2O對大型溞的24 h EC50分別為3.936和0.745? mg/L，48 h EC50分別為2.782和0.356? mg/L，且數(shù)據(jù)擬合度較好，可作為大型溞急性毒性試驗的參比毒物。苯酚對大型溞的急性毒性試驗數(shù)據(jù)擬合度較差，不適合作為大型溞急性毒性試驗的陽性參比毒物。

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