溶瘤病毒促進腫瘤細胞自噬的研究進展*

柯亨寧③

溶瘤病毒（oncolytic virus，OV）自身或借助人工生物工程的方式改造，使其可以特異性的感染并殺傷腫瘤靶細胞。雖然同時感染非腫瘤細胞，但不會在正常細胞內(nèi)復(fù)制，不會改變正常細胞內(nèi)的基因序列，而且對人體幾乎無明顯的不良反應(yīng)[1]。常見的OV包括腺病毒（adenovirus，Ad）、麻疹病毒（measles virus，MV）和水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）、呼腸孤病毒、新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）、單純皰疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus type 1，HSV1）、脊髓灰質(zhì)炎病毒、牛痘病毒。改造后OV具有多種腫瘤殺傷機制，包括病毒選擇性地在腫瘤細胞內(nèi)大量復(fù)制并直接引起腫瘤細胞裂解死亡[2]；通過溶解腫瘤細胞激活損傷相關(guān)分子模式，釋放腫瘤相關(guān)抗原刺激免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)[3]。此外，鑒于多數(shù)實體腫瘤表達表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），溶瘤Ad攜帶可以靶向作用EGFR元件-雙特異性T細胞銜接蛋白，以加強抗腫瘤效果[4]；呼腸孤病毒3型聯(lián)合光動力學(xué)療法有效殺傷胰腺癌細胞[5]。一項通過改造后使單純皰疹病毒（talimogene laherparepvec，T-VEC）誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）以治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的研究，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準用于Ⅲ期臨床試驗[6]。隨著對腫瘤機制研究的深入，自噬在抗腫瘤生長中的重要性逐漸被認識。自噬的形成是在環(huán)境的刺激下和（或）營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時被激活[7]。由自噬相關(guān)基因（autophagy as-sociated gene，Atg）來調(diào)控自噬的過程。營養(yǎng)缺乏激活雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、能量（adenosine monophosphate，AMP）、缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）感應(yīng)機制均可調(diào)節(jié)Atg基因產(chǎn)物。上述基因產(chǎn)物調(diào)控自噬通路的開通與閉合[8]。通過生物工程技術(shù)改造病毒來激活腫瘤細胞的自噬通路，從而促進腫瘤的自噬性死亡。

1 OV與mTOR

當(dāng)某些因素誘導(dǎo)自噬程序激活后可出現(xiàn)細胞死亡，又稱為Ⅱ型程序性細胞死亡。營養(yǎng)物質(zhì)和mTOR抑制自噬，而AMP活化蛋白激酶（AMPK）和HIF激活自噬。因為胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，又名Akt）/mTOR通路是一個自噬負性調(diào)控通路，通過對其下游因子mTOR作用來調(diào)控自噬[9]。所以當(dāng)mTOR被抑制時，自噬程序便被激活。L-肌肽是雷帕霉素的類似物，具有mTOR的抑制作用。將L-肌肽包裝到Ad中，再去感染腫瘤細胞就會誘導(dǎo)腫瘤的自噬產(chǎn)生[10]。EphA3是一種在血液系統(tǒng)腫瘤、淋巴瘤、腎癌、黑色素瘤等中有著高表達和高突變的癌基因，有研究通過使Ad攜帶人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）轉(zhuǎn)基因及1504-siRNA，可靶向作用于潛在致癌基因EphA3，特異性抑制和殺傷表達TERT和EphA3的腫瘤細胞，引起經(jīng)典自噬負性調(diào)節(jié)信號通路PI3K/Akt/mTOR的抑制，從而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[11]。由此實現(xiàn)了通過人工方法制備OV，主動激活腫瘤細胞中的自噬，誘導(dǎo)腫瘤細胞的死亡。此外，通過NDV（FMW株）抑制Akt/mTOR通路提高自噬水平抑制肺癌[12]。同時，mTOR抑制劑-雷帕霉素可以提高腫瘤中溶瘤T-VEC的含量和分布[13-14]，說明溶瘤T-VEC與mTOR抑制劑有協(xié)同抗腫瘤作用。mTOR可能成為OV治療腫瘤的一個重要靶點。Ad通過編碼兩種蛋白（E4-ORF1和E4-ORF4）來模擬營養(yǎng)/生長信號激活哺乳動物的mTOR，抑制自噬，促進病毒的復(fù)制。其中E4-ORF1通過激活PI3K，以活化mTOR；E4-ORF4和糖類堆積可以促進mTOR活化[15]，對自噬的抑制行為有利于病毒保證自身最大程度的復(fù)制。OV在腫瘤細胞中引起mTOR變化出現(xiàn)兩種相反的情況的深層機制尚待研究。

2 OV與Atg5

OV感染的腫瘤細胞中有Atg5參與自噬發(fā)生。Atg5為自噬標志分子LC3-Ⅰ（人微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈A）轉(zhuǎn)變到LC3-Ⅱ（人微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈B）的關(guān)鍵因子。有研究發(fā)現(xiàn)，Atg5參與經(jīng)典和非經(jīng)典的自噬。Atg5與Atg12、Atg16（L）構(gòu)成 Atg12-Atg5-Atg16（L）復(fù)合物。這種復(fù)合物定位在孤立膜的表面，其功能是使孤立膜延長，同時也是自噬體重要的膜標志物。Atg5參與自噬體的形成，是自噬程序開啟和運行的標志。呼腸孤病毒可以誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤細胞Atg12-Atg5的共軛、LC3的酯化、酸性空泡的形成，導(dǎo)致自噬過程的發(fā)生[16]。溶瘤Ad感染腦腫瘤干細胞后可使Atg12-Atg5復(fù)合物上調(diào)，從而生成大量的自噬體損壞胞膜，引起細胞死亡[17]。有研究通過抗氧化化合物蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）激活的轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（NRF2）信號途徑，誘導(dǎo)VSVΔ51的復(fù)制量增加，從而提高OV在腫瘤中的感染范圍。野生型小鼠成纖維細胞的OV滴度以及LC3-Ⅱ明顯高于Atg5敲除的小鼠（Atg5-/-）成纖維細胞的OV滴度以及LC3-Ⅱ水平[18]。結(jié)果提示腫瘤細胞自噬整體上可能阻斷了Ⅰ型干擾素的反應(yīng)，有利于OV的復(fù)制。利用siRNA介導(dǎo)敲低Atg5和Beclin-1的方式可以抑制NDV在神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞中介導(dǎo)的自噬，使瘤中的病毒復(fù)制水平明顯下降[19]。攜帶狂犬病毒糖蛋白（rL-RVG）的NDV感染人胃癌細胞系SGC-7901和AGS，可以增加自噬水平、抑制腫瘤細胞的生長，而通過siRNA技術(shù)特異性沉默Atg5后又使OV感染細胞自噬下降[20]。將Beclin-1 cDNA聯(lián)合SG511-BECN克隆到溶瘤Ad中，SG511-BECN誘導(dǎo)的細胞自噬性死亡，但這一過程可以通過敲低ATG5和ATG7而產(chǎn)生自噬部分逆轉(zhuǎn)，而且ATG5、ATG7敲低后可使SG511-BECN誘導(dǎo)的細胞生長抑制得以恢復(fù)生長[21]。由此可見，OV發(fā)揮良好的自噬效果，需以Atg5存在為前題。利用siRNA敲低肺癌A549/DDP（順鉑抗性）細胞的Atg5后，在NDV（FMW株）感染的腫瘤細胞中出現(xiàn)更多的壞死和凋亡，同時激活負性調(diào)節(jié)途徑抑制自噬[22]。研究結(jié)果提示OV抑制自噬，可能與Atg5的另一個功能相關(guān)：細胞死亡程序被誘導(dǎo)時，當(dāng)Atg5存在則細胞走向自噬的方向；當(dāng)鈣蛋白酶介導(dǎo)Atg裂解，則會激活細胞凋亡。

3 OV與自噬體

自噬的活性還依賴于自噬體的活化程度和溶酶體內(nèi)囊泡降解的程度。如果OV能誘發(fā)自噬體的形成及增加，便可將自噬程序進行下去。有研究發(fā)現(xiàn)，NDV在紫杉醇抵抗的A549細胞（A549/PTX）中誘導(dǎo)自噬體的形成。NDV（FMW株）的感染可以減少A549/PTX細胞中的Akt磷酸化水平，因PI3K/Akt/mTOR途徑對自噬有抑制作用，所以當(dāng)Akt減少時自噬程序便會激活[22]。此研究還觀察到在NDV感染的A549/PTX的細胞中有時間依賴性的Beclin-1增強表達。Beclin-1在自噬程序的首要階段中發(fā)揮重要作用，提示NDV感染的A549/PTX的細胞中Beclin-1誘導(dǎo)自噬體的形成。這個模型中Atg5也參與其中，因為Atg12-Atg5-Atg16（L）復(fù)合物參與了自噬體的形成，所以NDV可能誘導(dǎo)Beclin-1/Atg5/自噬體的通路激活自噬。HSV-1病毒因子ICP34.5可與Beclin結(jié)合，有利于Beclin-1和PI3KCⅢ的作用，促進自噬體的形成[23]，此外HSV-1還表達1種TOLL樣受體的重要配體-HMGB1，當(dāng)沉默HMGB1基因則發(fā)現(xiàn)自噬體的形成明顯減少[24]。除了OV正向誘導(dǎo)自噬程序外，已發(fā)生的自噬又可以反過來引起OV在腫瘤細胞中的擴增，使這個過程呈正反饋的表現(xiàn)，提示病毒對腫瘤細胞自噬的易化作用。有研究發(fā)現(xiàn)，某些病毒可以利用自噬體作為復(fù)制的位點，從而促進OV的復(fù)制和聚集[25]。利用這種機制，溶瘤效果便可產(chǎn)生瀑布樣擴大，其所產(chǎn)生的自噬效果也會同級擴大，就可能實現(xiàn)利用最小量的病毒量殺傷相當(dāng)數(shù)量腫瘤細胞。此外，在LC3相關(guān)吞噬作用中，LC3陽性吞噬體通過MHCⅡ類分子延長抗原呈遞時間[26]。由此可見，在OV的溶瘤效應(yīng)中自噬體扮演著主導(dǎo)自噬發(fā)生、易化自噬和抗原傳遞等“多面手”的角色。

4 OV與B淋巴細胞瘤-2基因

B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因編碼蛋白是Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白成員之一。Bcl-2家族分為：1）抗凋亡組（Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL）；2）促凋亡組（BAX、BAK）；3）BH3蛋白組（NOXA、PUMA、BID、BIM、BAD、BIK 和 BMF）。Beclin-1為BH3蛋白組的一員，也是具有調(diào)節(jié)自噬的核心作用的腫瘤抑制因子。Bcl-2蛋白通過BH3域與Beclin-1結(jié)合，Bcl-2蛋白抑制Beclin-1，進而抑制Beclin-1介導(dǎo)的自噬。如果抑制Bcl-2的功能，干擾Bcl-2的親Beclin-1作用，可以使Beclin-1執(zhí)行其正常誘導(dǎo)自噬的功能。有研究發(fā)現(xiàn)，通過VSV聯(lián)合Bcl-2抑制劑可以干擾Bcl-2對Beclin-1抑制作用，從而使慢性淋巴細胞白血病細胞發(fā)生更多的自噬和凋亡。如果單獨使用VSV或Bcl-2抑制劑則對阻止Bcl-2/Beclin-1結(jié)合作用甚微，但將二者聯(lián)合應(yīng)用幾乎完全地阻斷Bcl-2對Beclin-1的抑制。其中可能的機制為在Bcl-2抑制劑的協(xié)助下，VSV會通過Beclin-1激活自噬體的形成進而激活自噬通路[27]。NDV感染的腫瘤細胞通過下調(diào)Bcl-2，來增強Beclin-1介導(dǎo)的自噬[28]。溶瘤Ad感染腫瘤細胞，激活細胞中的JNK（cJun N-terminal kinase，JNK）途徑，引起B(yǎng)cl-2磷酸化，并使Bcl-2與Beclin-1分離，從而誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生[29]。溶瘤Ad作用于白血病細胞，可使細胞內(nèi)Bcl-2蛋白家族里的Bcl-2和Mcl-1下調(diào)，誘導(dǎo)細胞凋亡從而殺傷腫瘤細胞[30]。由此可見，利用OV作用Bcl-2既能推動自噬程序進行，同時又能使凋亡程序啟動，使這兩個機制協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。

5 OV與P62/SQSTM1

P62/SQSTM1為一種泛素結(jié)合蛋白核自噬受體（sequestosome 1，SQSTM1）。通常在自噬發(fā)生時其表達下降。P62有調(diào)節(jié)NRF2、mTOR和NF-κB的作用，而這些因子則在腫瘤信號通路中較為重要[31]。當(dāng)自噬被誘導(dǎo)時，會引起P62水平的降低和LC3的酯化。有研究發(fā)現(xiàn)在對骨肉瘤細胞系使用OV的Ad5-Δ24-RGD后可引起P62水平的下降、Beclin 1升高和LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化的增加[32]。其中機制可能為P62可以選擇性的與底物結(jié)合，激活自噬機制促進自噬體的形成，再與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，最后P62隨著底物降解而降解[33]。還有研究發(fā)現(xiàn)，減毒MV的Edmonston株可以觸發(fā)P62/SQSTM1介導(dǎo)的線粒體自噬，同時誘導(dǎo)腫瘤細胞內(nèi)線粒體相關(guān)的線粒體抗病毒信號蛋白（mitochondria antiviral signaling protein，MAVS）生成和減低內(nèi)部免疫反應(yīng)，由此可能為病毒的復(fù)制掃清障礙。其中可能的機制為線粒體自噬可以特異性清除被病毒損壞的線粒體，從而使被感染的腫瘤細胞發(fā)生死亡[34]。OV也可以控制腫瘤干細胞，ΔPK是一種單純皰疹病毒Ⅱ型突變體，有研究發(fā)現(xiàn)OV的ΔPK可對富含腫瘤干細胞的乳腺癌和黑色素瘤細胞產(chǎn)生溶瘤效應(yīng)，其可能機制是ΔPK誘導(dǎo)腫瘤細胞中的鈣蛋白激酶激活，再通過P62/SQSTM1的下調(diào)誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)[35]。所以，P62/SQSTM1也許是殺傷腫瘤干細胞的一個重要靶點。

綜上所述，OV通過多種正向及負向自噬相關(guān)途徑激活自噬發(fā)生（圖1）。比如通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路中的mTOR，降低其對自噬的抑制作用，促進自噬發(fā)生；通過影響P62下降引起的線粒體自噬；也可以通過抑制Bcl-2對Beclin 1的干擾，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生；還可以通過提高Beclin 1和Atg5的水平、促進自噬體形成。自噬體的形成也可以增加OV的復(fù)制水平。當(dāng)Atg5裂解后，自噬途徑則轉(zhuǎn)向壞死和凋亡方向。溶瘤Ad蛋白E4-ORF1及E4-ORF4激活mTOR，促進病毒復(fù)制，雖對自噬程序有抑制作用，但可以通過增加病毒量，增強直接溶瘤效果。

圖1 溶瘤病毒引起細胞自噬的途徑

6 問題與展望

OV作為新的治療手段存在諸多問題需要解決。如OV的滴度在腫瘤細胞內(nèi)可有效擴增，會引起細胞溶解。但是過多的擴增會引起細胞固有免疫反應(yīng)，與此同時會消耗病毒數(shù)量，降低自噬水平。許多研究是基于通過人工方法使OV攜帶有某些功能性元件，從而作用于自噬途徑，誘導(dǎo)自噬發(fā)生。其優(yōu)點在于有良好的靶向性，但是攜帶的功能元件是否可以使所有或者大部分的腫瘤發(fā)生自噬程序性死亡尚未可知，如作用在Atg5的病毒，感染細胞發(fā)生自噬或壞死、凋亡上應(yīng)該如何控制；作用在SQSTM1/P62的病毒，同時也可以誘導(dǎo)細胞發(fā)生Ⅰ類干擾素反應(yīng)。尋找自噬與免疫反應(yīng)間的的平衡點使患者的治療效果最大化，則可能是OV研制的難點之一。

盡管如此，利用OV技術(shù)抗腫瘤已開展許多臨床試驗。在中國，對頭頸部的腫瘤治療著重利用OV基因治療的方法。如利用表達P53的重組Ad和T-VEC（HSV）-胸苷激酶（TK）來治療腫瘤[36]。溶瘤 Ad（CG0070）在35例非肌層浸潤性膀胱癌患者中開展了Ⅰ期臨床試驗[37]；在前列腺腫瘤、腦部腫瘤、肝臟腫瘤和胰腺腫瘤中都開展了OV的Ⅰ期臨床試驗[38-41]。經(jīng)歐洲藥品管理局（EMA）人用藥品委員會（CHMP）和美國FDA批準，T-VEC可用于Ⅲb、Ⅲc、ⅣM1a期黑色素瘤的治療[42]。OV作為一種新興的抗腫瘤手段前景廣闊。