擬南芥At5g58100基因T-DNA純合插入突變體PCR鑒定及表型觀察

劉瑤 劉春宏 龐朝廷 高菊芳

摘 要： 以擬南芥SPOT1功能缺失突變體spot1和野生型（WT）植株為材料，比較研究了它們?cè)诨ǚ郯l(fā)育和結(jié)實(shí)率方面的差異.spot1-1，spot1-2和spot1-3突變體都能形成可育的三核花粉，但用掃描電子顯微鏡 （SEM） 觀察發(fā)現(xiàn)其花粉粒皺縮，花粉外壁存在紋理缺陷.用熒光顯微鏡觀察了這些花粉粒的樹脂半薄切片，發(fā)現(xiàn)花粉內(nèi)壁無(wú)纖維素的自發(fā)熒光，spot1突變體成熟果莢中的種子數(shù)量顯著少于野生型.對(duì)spot1-3突變體花藥發(fā)育過(guò)程進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)，從花粉母細(xì)胞時(shí)期開始，突變體細(xì)胞壁組成與野生型已出現(xiàn)差異.10 μmol·L-1（物質(zhì)的量濃度）茉莉酮酸既不能抑制黃化spot1幼苗的頂鉤反應(yīng)，又不能抑制1×10-6（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）乙烯利引起的夸張頂鉤反應(yīng).上述結(jié)果提示SPOT1基因的功能與小孢子初生外壁、花粉內(nèi)壁的發(fā)育，以及花絲伸長(zhǎng)（長(zhǎng)度）有密切關(guān)系，SPOT1可能與茉莉酮酸信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)聯(lián).

關(guān)鍵詞： 初生外壁; 花粉內(nèi)壁; 花絲伸長(zhǎng); 頂鉤反應(yīng); 茉莉酮酸

中圖分類號(hào)： Q 78; Q 943 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)： 1000-5137（2019）05-0503-08

Abstract： The differences between the spot1 mutants and wild type （WT） in their pollen development and spikelet fertility were compared in the paper.The pollen grains with spot1 mutants （spot1-1，spot1-2 and spot1-3） were shrunken and spotty in exine pattern by scan electron microscopy （SEM） observation，although they can all develop into male fertile pollens.There was no blue fluorescence in pollen wall at trans-section pollen grains by fluorescence microscope analysis.The average number of seeds in mature fruit pods with mutants is significant less than that of wild type because of insufficient pollination.The earliest change in the cell wall component occurs at the microspore mother cell stage of anther development by observation the sequential transverse sections of the spot1-3 mutant flower inflorescence.10 μmol·L-1 jasmonic acid treatment can neither inhibit the curvature of apical hook of etiolated spot1 mutant seedling，nor inhibit ethylene from promoting the formation of apical hook of etiolated spot1 mutant seedling.The results indicated that the function of SPOT1 gene might involve in the construction development of primexine and intine，and in filament elongation.SPOT1 gene might be related to jasmonic acid signal transduction pathway.

Key words： primexine; intine; filament elongation; apical hook response; jasmonic acid

0 引 言

花粉細(xì)胞壁在幫助雄配子抵御環(huán)境壓力、微生物侵襲，以及在細(xì)胞識(shí)別中都起到重要作用.它由來(lái)自配子體的花粉內(nèi)壁和來(lái)自孢子體的花粉外壁組成[1-2].當(dāng)小孢子開始有絲分裂時(shí)，會(huì)在細(xì)胞膜與外壁中間分泌一層致密的物質(zhì)——內(nèi)壁.內(nèi)壁的化學(xué)成分主要是果膠和纖維素，其生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)特征與經(jīng)典的植物細(xì)胞壁類似[3].纖維素的分子結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單，為不分支的β-1，4-葡聚糖鏈.通常數(shù)十條葡聚糖鏈組裝成索狀的結(jié)晶態(tài)微纖絲，微纖絲將進(jìn)一步聚集成纖維素的高級(jí)結(jié)構(gòu)，成為細(xì)胞壁的基本骨架[4].目前對(duì)花粉內(nèi)壁的形成及調(diào)控的分子機(jī)制所知甚少，由于 3個(gè)涉及初生壁纖維素合成酶基因的突變體都是雄性不育突變體，其花粉壁也不正常，因此認(rèn)為小孢子表面纖維素的沉積對(duì)于花粉壁的發(fā)育來(lái)說(shuō)至關(guān)重要[5].另外，擬南芥中AtUSP是一個(gè)編碼UDP-sugar 焦磷酸化酶的基因，突變體表型為外壁正常，而敗育的小孢子內(nèi)壁特異缺失，其突變體表現(xiàn)出配子體敗育表型[6].

花粉外壁又可分為蜂窩狀的外壁外層以及平坦的外壁內(nèi)層.外壁外層是由網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)的柱狀結(jié)構(gòu)、頂蓋層，和填充在它們之間空隙的含油層構(gòu)成.花粉外壁的主要構(gòu)成是孢粉素[3].研究發(fā)現(xiàn)小孢子在四分體 （Tds） 時(shí)期形成的暫時(shí)細(xì)胞壁基質(zhì)——初生外壁為花粉外壁的形成提供了模板，決定了后期花粉外壁的紋理[7-8].近年來(lái)，通過(guò)對(duì)花粉壁發(fā)育缺陷突變體的研究，DEX1，RPG1，NPU，EFD，SPONGY，UPEX等多個(gè)與初生外壁發(fā)育相關(guān)的基因得以被克隆，這些基因的功能缺失突變體在花粉發(fā)育過(guò)程中均表現(xiàn)出初生外壁的結(jié)構(gòu)異常，從而造成花粉外壁紋理缺陷[9-15].

花絲是開花植物雄性生殖器——雄蕊的組成部分，花絲伸長(zhǎng)將花藥托起，使成熟的花粉粒 （PG） 落到柱頭上進(jìn)而完成授粉受精過(guò)程，因此花絲的正常發(fā)育對(duì)于種子植物繁衍后代至關(guān)重要.研究表明：茉莉酮酸（JA） 直接參與調(diào)控花藥開裂、花粉成熟和花絲伸長(zhǎng)[16-17].

At5g58100基因編碼一種功能未知蛋白，DOBRITSA等[18]在大規(guī)模篩選花粉壁發(fā)育缺陷突變體時(shí)發(fā)現(xiàn)At5g58100基因的3個(gè)根癌農(nóng)桿菌DNA（T-DNA）純合插入等位突變獨(dú)立株系 （SALK_061320c，SALK_041228和SALK_079847），它們插入At5g58100基因的不同位置，但是均導(dǎo)致花粉外壁的相似表型缺陷——花粉外壁缺乏頂蓋，表明At5g58100基因與孢粉素的沉積模式有關(guān).他們將這種花粉壁發(fā)育缺陷突變體命名為spot1突變體.

為了進(jìn)一步研究At5g58100基因的功能，本文作者觀察了spot1突變體的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)過(guò)程、花粉發(fā)育過(guò)程，發(fā)現(xiàn)spot1突變體小孢子初生外壁和花粉內(nèi)壁發(fā)育異常，而且由于花開放時(shí)花絲伸長(zhǎng)（長(zhǎng)度）不足造成授粉不足，使突變體的結(jié)實(shí)率顯著低于野生型 （WT） 的結(jié)實(shí)率.在此基礎(chǔ)上，利用黃化幼苗的頂鉤反應(yīng)，觀察了spot1突變體種子對(duì)茉莉酮酸處理和乙烯利處理的反應(yīng).結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 μmol·L-1茉莉酮酸既不能抑制黃化spot1幼苗的頂鉤反應(yīng)，也不能抑制1×10-6（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）乙烯利引起的夸張頂鉤反應(yīng).上述結(jié)果提示SPOT1可能作為茉莉酮酸信號(hào)傳導(dǎo)通路的組成成分之一，參與小孢子初生外壁和花粉內(nèi)壁的發(fā)育以及花絲伸長(zhǎng)反應(yīng).

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）：Columbia（Col）生態(tài)型種子，由楊仲南教授實(shí)驗(yàn)室繼代種植培養(yǎng)所得.

將從SALK突變體庫(kù)購(gòu)買的7種At5g58100基因的T-DNA插入突變體（salk-072486，salk-073032，salk-041237，salk-041228，salk-072490，salk-079847，salk-06130c）種子種下，經(jīng)過(guò)掃描電子顯微鏡 （SEM） 篩選、T-DNA插入，鑒定得到At5g58100基因的T-DNA純合插入突變體spot1-1（salk_072490），spot1-2（salk_079847）和spot1-3（salk_061320c）.

植物種植方法參照文獻(xiàn)[19].

1.2 方 法

1.2.1 T-DNA插入及插入位點(diǎn)鑒定

提取野生型和spot1突變體植株DNA的方法參照文獻(xiàn)[19].利用TAIR （http：//www.arabidopsis.org/） 網(wǎng)上提供的引物序列（LB1.3：

ATTTTGCCGATTTCGGAAC;

SALK_079847LP AGCTTGCTCTTTGTGAAGGTG，

SALK_079847 RP CAATGCAGGATCCTCAGAGAG;

SALK_072490LP GCAGTTGCAGGTACTATTCGC，

SALK_072490RP TCCATTCGTCTTAGTGCATCC;

SALK_061320c LP AAAGGAGCCAACCTTGAGAAG，

SALK_061320c RP AAAGAAGCCTTTCCTTGATGC）

分別進(jìn)行左邊界序列（LP）引物 +右邊界序列（RP）引物和通用（LB）引物+ RP引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），純合插入植株的LB+RP PCR反應(yīng)產(chǎn)物送上海杰李生物技術(shù)有限公司測(cè)序，通過(guò)旁臨序列分析獲得T-DNA插入位點(diǎn).

1.2.2 SPOT1基因表達(dá)量測(cè)定

根據(jù)trizol 試劑盒的說(shuō)明提取野生型和spot1突變體花序RNA，并用DNA酶處理得到純化的RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA.根據(jù)突變體基因組中T-DNA的插入位點(diǎn)設(shè)計(jì)3對(duì)引物EX13 F TTATCGATTTAACTGCTGGCC，EX15 R CCTTCACAAAGAGCAAGCTTC（spot1-1）;EX17 F AAAATTACACAGTTGCACGC，EX19R ATATGAACGAACAGTCTTCCG（spot1-2）;EX19 F TTAACACTCTCTGAGGATCCTG，EX20 R CCATAATAGTGATCGCCCG （spot1-3）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）.反應(yīng)體系（20 μL）：SYBR Green I master mix：10 μL，引物F：0.4 μL，引物R：0.4 μL，cDNA：0.7 μL，水：8.5 μL，每對(duì)引物重復(fù)3次，在ABI PRISM 7300 detection system上進(jìn)行擴(kuò)增.以野生型的表達(dá)量為1計(jì)算突變體的相對(duì)表達(dá)量.

1.2.3 植株生殖生長(zhǎng)和花粉發(fā)育觀察

野生型和突變體植株從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)渡到生殖生長(zhǎng)后兩周，隨機(jī)各抽取10株植株，測(cè)定最早出現(xiàn)的5個(gè)果莢中的種子數(shù)量，求得平均值和標(biāo)準(zhǔn)差;每株選取一朵處于盛開的花，測(cè)量四強(qiáng)雄蕊和雌蕊的長(zhǎng)度，四強(qiáng)雄蕊的長(zhǎng)度取平均值記錄結(jié)果.

13期花粉中細(xì)胞核的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，花粉外貌的SEM觀察，樹脂半薄切片樣品制備和觀察方法參照文獻(xiàn)[20].

1.2.4 對(duì)茉莉酮酸和乙烯利響應(yīng)能力的觀察

將野生型和spot1突變體種子作除菌處理，春化3 d后播種在1/2 MS培養(yǎng)基、含10 μmol·L-1 JA的1/2 MS培養(yǎng)基、含1×10-6乙烯利的1/2 MS培養(yǎng)基，以及含1×10-6乙烯利+10 μmol·L-1 JA的1/2 MS培養(yǎng)基上，用錫箔紙包裹培養(yǎng)皿，22 ℃培養(yǎng)3 d.每個(gè)條件重復(fù)3次.培養(yǎng)結(jié)束后，在每種條件培育的組中隨機(jī)抽取不少于10個(gè)幼苗個(gè)體，將它們放置于具有黑色背景的培養(yǎng)皿中，在相同放大倍數(shù)的解剖鏡下拍照，保存照片.根據(jù)照片的比例，測(cè)定記錄不同條件下生長(zhǎng)的幼苗的頂鉤角度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.通過(guò)組間差異顯著性檢驗(yàn)，判斷spot1突變體對(duì)茉莉酮酸和乙烯利的響應(yīng)能力.

2 結(jié) 果

2.1 SPOT1功能缺失突變體的獲得和鑒定

為了獲得SPOT1功能缺失突變體，從SALK突變體庫(kù)購(gòu)買了針對(duì)At5g58100基因的7個(gè)株系（salk_072486，salk_073032，salk_041237，salk_072490，salk_079847，salk_061320c和salk_041228）的T-DNA插入突變體的種子.植株開花后提取花序總DNA，利用T-DNA上特異性引物L(fēng)B及基因上的引物L(fēng)P，RP，從salk_072490，salk_079847，salk_061320c株系中鑒定出了純合的T-DNA插入突變體.用SEM觀察13期花粉的外貌，發(fā)現(xiàn)花粉外壁發(fā)育缺陷與T-DNA純合插入緊密連鎖，將其分別命名為spot1-1（salk_072490），spot1-2（salk_079847）和spot1-3（salk_061320c）突變體，如圖1（a），1（f）所示.用LB及各自的RP引物擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切取含目的片段的瓊脂糖膠，回收后，用T-DNA特異的LB引物進(jìn)行測(cè)序.測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)spot1-1突變體的T-DNA插在SPOT1基因組的ATG下游3502 bp處（第14個(gè)內(nèi)含子），spot1-2突變體的T-DNA插在該基因ATG下游4453 bp處（第17個(gè)內(nèi)含子），spot1-3突變體的T-DNA插在該基因ATG下游5657 bp處（第20個(gè)外顯子），如圖1（b）所示.

為了解T-DNA純合插入對(duì)SPOT1基因表達(dá)的影響，在3種突變體T-DNA兩側(cè)的外顯子序列處，設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，分別是spot1-1：EX13F，EX15R;spot1-2：EX17 F，EX19R;spot1-3：EX19 F，EX20 R進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR.qRT-PCR結(jié)果顯示：在3種突變體背景下 SPOT1基因在花苞中的表達(dá)量顯著下調(diào)，如圖1（c）所示.這表明T-DNA的插入導(dǎo)致At5g58100基因在花器官中的正常表達(dá)被阻斷.至此，獲得了3個(gè)獨(dú)立株系的SPOT1功能缺失突變體spot1-1，spot1-2和spot1-3.

2.2 spot1突變體表型的初步觀察

觀察發(fā)現(xiàn)spot1突變體在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期與野生型沒(méi)有顯著差異，但在生殖生長(zhǎng)時(shí)期卻出現(xiàn)了明顯不同，主要表現(xiàn)為spot1突變體果莢短小，成熟花粉皺縮，和花粉外壁紋理缺陷，如圖1（d），1（f）所示，雖然DAPI染色表明13期花藥中的花粉粒均為三核花粉，如圖1（g）所示，亞歷山大染色表明花粉都是可育的，如圖1（e）所示.與野生型盛開的花相比，spot1突變體花的萼片、花瓣及花藥的形態(tài)和數(shù)目均正常，但是花絲的長(zhǎng)度略短.野生型擬南芥花絲頂端的花藥通常高于柱頭，而突變體花絲頂端的花藥剛剛能夠著柱頭或者在柱頭之下，如圖1（h）所示.

統(tǒng)計(jì)分析表明野生型每個(gè)果莢中的種子數(shù)量平均為（28±2）粒，極其顯著地高于spot1-1突變體的（17±5）粒、spot1-2突變體的（9±4）粒和spot1-3突變體的（14±6）粒（表1）.從表1中還可以看到，spot1-1突變體雄蕊與雌蕊長(zhǎng)度之差為（0.28±0.13） mm，spot1-2突變體雄蕊與雌蕊長(zhǎng)度之差為（-0.10±0.12） mm，spot1-3突變體雄蕊與雌蕊長(zhǎng)度之差為（0.15±0.10） mm，與野生型雄蕊與雌蕊長(zhǎng)度之差[（0.55±0.12）mm]相比，均具有極其顯著的差異.上述結(jié)果表明，spot1突變體雄蕊與雌蕊在生長(zhǎng)發(fā)育上的不協(xié)調(diào)，影響了正常的授粉，從而導(dǎo)致結(jié)實(shí)率的下降.

2.3 spot1突變體花粉內(nèi)壁結(jié)構(gòu)缺乏纖維素成分

為了尋找造成spot1突變體花粉外壁紋理缺陷的原因，利用熒光顯微鏡技術(shù)對(duì)spot1-3突變體花序的樹脂半薄連續(xù)切片進(jìn)行了觀察.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在花藥發(fā)育的第6期，野生型擬南芥小孢子母細(xì)胞 （MMC） 細(xì)胞壁的主要成分是胼胝質(zhì)，與苯胺藍(lán)水溶液反應(yīng)后，在紫外光激發(fā)下發(fā)出黃綠色熒光，如圖2（a）所示.而spot1-3突變體小孢子母細(xì)胞細(xì)胞壁發(fā)出的熒光比較弱且偏藍(lán)色，如圖2（e）所示，提示突變體小孢子母細(xì)胞細(xì)胞壁的成分發(fā)生了變化.在花藥發(fā)育的第7期，野生型藥室中的四分體不僅四周包裹的胼胝質(zhì)壁發(fā)出較強(qiáng)的黃綠色熒光，而且小孢子之間新生的分隔帶也發(fā)出屬于胼胝質(zhì)的強(qiáng)烈黃綠色熒光，如圖2（b）所示.而盡管小孢子之間新生的分隔帶發(fā)出微弱的黃綠色熒光，spot1-3突變體藥室內(nèi)的包裹四分體的細(xì)胞壁發(fā)出的是偏藍(lán)色的熒光，如圖2（f）所示.在花藥發(fā)育的第11期，二核花粉會(huì)在質(zhì)膜和花粉外壁之間形成以纖維素為主要結(jié)構(gòu)成分的內(nèi)壁.由于纖維素有自發(fā)熒光，所以在野生型第11期以后的藥室里，在紫外光激發(fā)下可以看到有一個(gè)藍(lán)色的圓環(huán)圍繞在花粉粒的四周，如圖2（c），2（d）所示.與此相對(duì)應(yīng)地，spot1-3突變體同期的藥室里沒(méi)有藍(lán)色圓環(huán)圍繞花粉粒，如圖2（g），2（h），圖3（f）所示;成熟的spot1-1突變體花粉粒外壁之內(nèi)雖有藍(lán)色熒光，如圖3（g）所示，但比野生型的弱得多;成熟的spot1-2突變體花粉粒外壁之內(nèi)的熒光偏黃綠色，類似胼胝質(zhì)發(fā)出的熒光.上述結(jié)果表明：SPOT1功能的缺失使突變體雄配子細(xì)胞壁中胼胝質(zhì)和纖維素等結(jié)構(gòu)成分的合成發(fā)生異常，表現(xiàn)為小孢子母細(xì)胞時(shí)期胼胝質(zhì)合成減少，纖維素合成增多，而二核花粉期后，內(nèi)壁纖維素合成顯著減少，胼胝質(zhì)合成可能增加.因此，spot1突變體花粉外壁孢粉素沉積異?？赡苁浅跎獗诮Y(jié)構(gòu)異常的結(jié)果，而花粉外形皺縮是由于缺乏花粉內(nèi)壁纖維素的支撐.

2.4 spot1突變體對(duì)茉莉酮酸刺激無(wú)應(yīng)答

植物激素JA和乙烯（ET）可協(xié)同調(diào)控植物防御和器官發(fā)育，兩者之間還存在拮抗作用，表型之一就是乙烯利促進(jìn)避光生長(zhǎng)的種苗形成頂端彎鉤，而JA抑制這一過(guò)程.依據(jù)spot-1突變體因花絲伸長(zhǎng)不足造成結(jié)實(shí)率顯著下降的現(xiàn)象，推測(cè)SPOT-1蛋白的功能可能與茉莉酮酸信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān).將野生型和spot1春化后的種子播種在不同基質(zhì)的1/2 MS培養(yǎng)基上避光生長(zhǎng)3 d，3日齡黃化幼苗的頂鉤彎曲度如圖4所示，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表2所示.

由圖4和表2可知：在正常生長(zhǎng)條件下（1/2 MS培養(yǎng)基），3日齡黃化spot1-3幼苗的頂鉤彎曲度[（179±7）°]顯著大于3日齡黃化野生型幼苗的頂鉤彎曲度[（140±14）°].在1×10-6乙烯利處理下，3日齡黃化spot1-3幼苗與黃化野生型幼苗一樣形成夸張的頂端彎曲，彎曲度分別為 （350±8）° 和 （345±7）°，兩者沒(méi)有顯著性差異.在10 μmol·L-1 JA處理下，3日齡黃化野生型幼苗的頂鉤彎曲度受到抑制，為 （83±16）°，而3日齡黃化spot1-3幼苗的頂鉤彎曲度不受影響，為 （164±22）°.在1×10-6乙烯利和10 μmol·L-1 JA同時(shí)存在的條件下，JA抑制了乙烯促進(jìn)黃化野生型幼苗頂鉤形成的作用，其彎曲度為 （170±8）°，但JA不能抑制乙烯促進(jìn)黃化spot1-3幼苗頂鉤形成的作用，其彎曲度為 （348±9）°.上述結(jié)果表明spot1-3突變體對(duì)外源乙烯刺激的反應(yīng)能力正常，但失去了對(duì)內(nèi)源和外源JA刺激的反應(yīng)能力，提示SPOT1蛋白可能是茉莉酮酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵成分之一.

3 討 論

根據(jù)SPOT1基因的突變會(huì)影響花粉外壁紋理形成的研究報(bào)道[18]，首先利用SEM技術(shù)觀察花粉外貌，再結(jié)合T-DNA插入位點(diǎn)鑒定及T-DNA旁臨序列分析等技術(shù)，獲得了3個(gè)獨(dú)立的SPOT1基因功能缺失株系spot1-1，spot1-2和spot1-3，再次證實(shí)SPOT1確實(shí)參與花粉外壁紋理的形成.

研究結(jié)果表明：SPOT1功能缺失突變體spot1失去了對(duì)內(nèi)源性和外源性茉莉酮酸的反應(yīng)能力，改變了小孢子母細(xì)胞細(xì)胞壁、四分體時(shí)期小孢子初生外壁和花粉內(nèi)壁的結(jié)構(gòu)成分，使花絲伸長(zhǎng)與柱頭發(fā)育不協(xié)調(diào)，造成了spot1成熟花粉外壁結(jié)構(gòu)缺陷，內(nèi)壁缺乏纖維素剛性支撐而皺縮，以及果莢中種子數(shù)量顯著下降等結(jié)果.本研究結(jié)果為進(jìn)一步從分子水平研究SPOT1的作用機(jī)制提供了參考.

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（責(zé)任編輯：顧浩然）