盤龍七中黃酮抗氧化活性的評(píng)價(jià)研究

張韞 高蘇亞 唐一梅 高慧 鄧佩穎

摘 ?????要：以黃酮清除率為指標(biāo)，以抗壞血酸為對(duì)照，運(yùn)用紫外-可見分光光度法和熒光光譜法測定了黃酮對(duì)自由基的清除能力，評(píng)價(jià)盤龍七中黃酮的抗氧化活性。紫外-可見分光光度法測定黃酮對(duì)羥自由基的最大清除率達(dá)97.5%;對(duì)超氧陰離子的最大清除率達(dá)98.0%，對(duì)亞硝酸鹽的最大清除率為60.0%;熒光光譜法測定黃酮對(duì)羥自由基的最大清除率為83.9%，對(duì)超氧陰離子的最大清除率為87.0%，且盤龍七中黃酮的抗氧化活性均優(yōu)于抗壞血酸。盤龍七中黃酮對(duì)三種自由基的清除能力順序?yàn)槌蹶庪x子>羥自由基>亞硝酸鹽。對(duì)盤龍七中總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，可為盤龍七藥材的抗氧化性能的深入開發(fā)和利用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。

關(guān) ?鍵 ?詞：盤龍七;黃酮;抗氧化;自由基

中圖分類號(hào)：TQ031.7 ???????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ??????文章編號(hào)： 1671-0460（2019）08-1651-05

Abstract： Taking the clearance rate of flavone as an indicator， using vitamin C as control， the scavenging ability of flavone to free radicals was studied to evaluate antioxidant activity of flavone by ultraviolet- visible?spectrophotometry? and fluorescence spectrophotometry. The optimum ultrasonic extracting conditions for flavone was discussed and its antioxidant activity was evaluated. The results showed that the maximum clearance rates of hydroxyl free radical， superoxide anion and nitrite determined by ultraviolet-visible spectrophotometry were 97.5% ，98.0% and 60%; The maximum clearance rate of hydroxyl free radical and superoxide anion determined by fluorescence method was 83.9% and 87%. The order of clearance rate was superoxide anion > hydroxyl free radical > nitrite. The antioxidant activity of flavone from Rhizome Bergeni Scopulosae was evaluated， which could provide reference for the further exploitation， utilization and quality control of Rhizome Bergeni Scopulosae.

Key words： Rhizome Bergeni Scopulosae; Flavone; Antioxidant activity; Free radical

盤龍七為虎耳草科巖白菜屬植物巖白菜的干燥根莖，多年生草本植物，多生長在陰濕的懸崖絕壁，分布于秦嶺太白山、柞水、長安太平裕等地。盤龍七作為陜西地區(qū)的民間常用藥，具有收澀固腸、補(bǔ)益脾胃、利水活血、活血化瘀、利水活血，祛風(fēng)除濕、消腫止痛等功效[1]，其中主要含有巖白菜素、多元酚、黃酮、蒽醌、多糖等成分，其中黃酮是其重要的活性成分。黃酮類化合物具有抗抑郁、抗氧化、消炎鎮(zhèn)靜和提高免疫力等作用[2]。盤龍七黃酮具有清除自由基、抗衰老、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抗疲勞、改善心血管等多種生理功能[3，4]。

自由基是生物體在代謝過程中不斷產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，如果體內(nèi)的自由基聚集過多，就會(huì)損傷機(jī)體功能，加速衰老過程并可能引發(fā)各類疾病。目前文獻(xiàn)中常用到的評(píng)價(jià)黃酮抗氧化活性的方法主要有羥自由基、超氧陰離子、亞硝酸鹽清除法[5]。本實(shí)驗(yàn)以黃酮作為自由基清除劑，采用紫外光譜法和熒光光譜法對(duì)黃酮清除羥自由基、亞硝酸鹽及超氧陰離子的能力進(jìn)行測定，反映盤龍七黃酮的抗氧活性。抗壞血酸（VC）是一種良好的自由基清除劑，以VC的清除率作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，為實(shí)驗(yàn)提供了良好的參考依據(jù)。結(jié)果表明，盤龍七中黃酮的抗氧化活性均優(yōu)于VC。

本實(shí)驗(yàn)的研究為黃酮提取的工業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)，為盤龍七藥材的進(jìn)一步開發(fā)利用和質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?實(shí)驗(yàn)儀器

FW200A高速萬能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）;智能型電熱恒溫鼓風(fēng)機(jī)干燥箱（上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任和公司）;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（河北黃驊市航天儀器廠）;UV-762型紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器有限公司）;熒光分光光度計(jì)（LS-55，PerkinElmer有限公司）。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)試劑

盤龍七藥材（不同產(chǎn)地）經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室汪興軍老師鑒定為Bergenia scopulosa T. P. Wang的根莖。蘆?。ㄅ?hào)20140919，純度98%，上海士鋒生物科技有限公司）;焦性沒食子酸（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）;苯甲酸（分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司）;N-1-萘乙二胺鹽酸鹽（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）;無水對(duì)氨基苯磺酸（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）;其余試劑均為分析純。

2 ?實(shí)驗(yàn)方法

2.1 ?樣品采集與處理

取盤龍七藥材適量，洗去泥沙，粉碎過40目篩。精確稱取100 g粉碎后的盤龍七粉末于圓底燒瓶中，加入1.5倍量的石油醚回流去脂質(zhì)等干擾成分[6]，抽濾后于烘箱55 ℃烘干備用。

2.2 ?提取方法

精確稱取5.0 g處理后的盤龍七粉末置于燒杯。以蘆丁為對(duì)照品，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測定黃酮含量。經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[7]，以黃酮含量為指標(biāo)，按照乙醇濃度60%，料液比為1∶25，提取時(shí)間60 min，提取3次的條件，超聲提取總黃酮，結(jié)束后抽濾，收集濾液。濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，備用。

2.3 ?紫外-可見分光光度法的測定方法

2.3.1 ?盤龍七黃酮對(duì)羥自由基的清除能力

水楊酸（鄰羥基苯甲酸）通過捕獲·OH產(chǎn)生了有顏色的分子，該分子在510 nm的可見區(qū)有吸收峰。實(shí)驗(yàn)通過測定鄰羥基苯甲酸捕獲·OH所生成的產(chǎn)物分子，來計(jì)算黃酮對(duì)·OH的自由基清除率[8]。

將不同濃度的黃酮提取液分別加入10 mL容量瓶，再依次加入2.0 mmol/L硫酸亞鐵2.0 mL和6.0 mmol/L水楊酸溶液2.0 mL，充分搖勻后加入1.0 mmol/L過氧化氫2.0 mL作為反應(yīng)的啟動(dòng)劑，將容量瓶置于37 ℃條件下的水浴中加熱0.5 h，以H2O為參比，采用紫外-可見分光光度法測定吸光度A。由于考黃酮提取液自身有紫外吸收，以試樣空白為空白溶液，測出扣除空白的吸光度為A1，并測出空白對(duì)照液吸光度A0[9]，依據(jù)公式（1）算羥自由基的清除率。同法測定相同濃度下VC的清除率。

2.3.2 ?盤龍七黃酮對(duì)亞硝酸鹽的清除能力

NO2-在酸性條件下與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮反應(yīng)后，再與N-1-苯基乙二胺鹽酸鹽偶合生成紫紅色絡(luò)合物在540 nm處有最大吸收，可用比色法測定NO2-的含量[10，11]。

在10 mL的容量瓶中加入不同濃度的黃酮提取液，加入5.0 μg/mL的NaNO2 2.0 mL，再將容量瓶放在37 ℃水浴鍋中水浴加熱反應(yīng)0.5 h，各容量瓶依次加入2.0 mL的0.4%對(duì)氨基苯磺酸（Sulfanilic acid），充分搖勻并靜置反應(yīng)5 min;再精密吸取顯色劑0.2%鹽酸萘乙二胺1.0 mL加入容量瓶中，以H2O定容后反應(yīng)15 min，以H2O為參比，測定各溶液的吸光度，考慮到提取液本身的吸光度，做試樣空白，測出扣除試樣空白的吸光度A1，同時(shí)測定空白對(duì)照液的吸光度A0，按公式（1）計(jì)算清除率。

2.3.3 ?盤龍七黃酮對(duì)超氧陰離子的清除能力

鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產(chǎn)生超氧陰離子，此物質(zhì)在320 nm處有特征吸收，可用比色法測定超氧陰離子的含量[8]。

將不同濃度的黃酮提取液配制成不同濃度的溶液， 取4.5 mL的5.0×10-5 mol/L的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液（pH=8.2），置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min后，分別精密加入1.0 mL樣品液和0.4 mL焦性沒食子酸25 mmol/L溶液，充分搖勻后于25 ℃水浴鍋中反應(yīng)5 min，加入8 mmol/L 鹽酸 1.0 mL作為反應(yīng)終止劑，在320 nm波長下測定吸光度，記為A1，空白組以等體積H2O代替樣品液，用紫外法測定吸光度記為A0 [10，12，13]。測得的數(shù)據(jù)代入公式（1）計(jì)算清除率。

2.4 ?熒光分光光度法的測定方法

2.4.1 ?盤龍七中黃酮對(duì)羥自由基的清除能力

Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基并發(fā)熒光，遇自由基清除劑后熒光減弱，通過熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算羥自由基的清除率。

在10 mL的具塞試管中，依次加入KH2PO4- Na2HPO4緩沖溶液（pH=5.47） 2.0 mL，1.0 mmol/L苯甲酸溶液2.0 mL，加入1.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液0.6 mL，0.3%的過氧化氫溶液1.2 mL，加H2O定容搖勻，反應(yīng)2 h，用熒光分光光度計(jì)掃描確定最大激發(fā)波長及發(fā)射波長[14]。按上述方法加入試劑，以λex/λem=287/407 nm為測定波長，狹縫均為10 nm，掃速為300 nm/min，測定體系的熒光強(qiáng)度F，計(jì)算其與參比溶液（苯甲酸與緩沖溶液）熒光強(qiáng)度F0之差△F，并計(jì)算體系生成的·OH的含量[14]。在的Fenton體系中，先加入盤龍七的黃酮提取液再加入硫酸亞鐵溶液。并測定Fenton體系的熒光強(qiáng)度Fs，則·OH清除率的計(jì)算見公式（2）：

2.4.2 ?盤龍七黃酮對(duì)超氧陰離子的清除能力

鄰苯三酚在堿性條件下（pH=8.18緩沖溶液）自氧化生成超氧自由基，黃酮類物質(zhì)可與Al（Ⅲ）形成絡(luò)合物，以絡(luò)合物在與O2-反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度的變化幅度作為檢測其清除能力的指標(biāo)[12]。

在具塞試管中加入一定濃度的黃酮提取液和0.8 mL Al（NO3）3搖勻，稀釋至5 mL，5 min后以λex/λem=320/417 nm為測定波長，狹縫均為10 nm，掃速300 nm/min，測其熒光強(qiáng)度F0。在試管中加入Tris-HCl （pH=8.2）緩沖溶液2.0 mL，在25 ℃中加熱10 min，再加入預(yù)熱過的鄰苯三酚0.1 mL，立即加入不同濃度的黃酮提取液，反應(yīng)4 min后加入Al（Ⅲ）搖勻，稀釋至5.0 mL，測其熒光強(qiáng)度F1，計(jì)算清除率見公式（3）：

3 ?結(jié)果與討論

3.1 ?紫外-可見分光光度法的測定結(jié)果

由圖1可以看出，隨著黃酮濃度增大，對(duì)·OH清除作用依次增強(qiáng)[15]。當(dāng)濃度為8.0 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到97.5%;相同濃度范圍下，VC的清除率一直保持在4.0%左右，說明此濃度范圍下，黃酮對(duì)羥基的清除能力優(yōu)于VC。

由圖2可以看出，盤龍七黃酮在0.54～5.43 μg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)亞硝酸鹽的清除率呈不斷增長的趨勢，在5.43～13.03 μg/mL濃度范圍內(nèi)清除率在60.0%左右逐漸平穩(wěn)并略有下降趨勢;在相同的濃度范圍內(nèi)，VC的清除率雖有平穩(wěn)但仍有上升的趨勢。在此濃度范圍內(nèi)，黃酮對(duì)亞硝酸鹽的清除率仍優(yōu)于VC。

由圖3可以看出盤龍七黃酮對(duì)超氧陰離子的清除率隨濃度的增大而逐漸增大，濃度為13.03 μg/mL時(shí)清除率達(dá)到98.0%;VC在相同的濃度范圍內(nèi)清除率較小，并且不超過13.0%。結(jié)果表明，在此濃度范圍內(nèi)，黃酮對(duì)超氧陰離子的清除能力優(yōu)于VC。

3.2 ?熒光分光光度法的測定結(jié)果

由圖4可以看出，隨著加入黃酮提取液的濃度增大，熒光強(qiáng)度逐漸減小;說明黃酮在此反應(yīng)中屬熒光猝滅劑。以黃酮濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)作圖。

盤龍七黃酮對(duì)羥自由基的清除率隨濃度的增大而增大，在濃度為4 μg/mL時(shí)清除率穩(wěn)定，達(dá)到83.9%。

由圖5、6可以看出，加入鄰苯三酚體系后最大波長發(fā)生變化;說明物質(zhì)之間可能存在相互作用導(dǎo)致原物質(zhì)的分子能級(jí)發(fā)生了改變。

4 ?結(jié) 論

盤龍七黃酮對(duì)羥自由基及超氧陰離子的清除率達(dá)98%，對(duì)亞硝酸鹽的清除率達(dá)60%，且均優(yōu)于VC，結(jié)果表明，盤龍七是一種良好的天然抗氧化劑，可作為具有抗氧化活性的天然藥物，其抗氧化性應(yīng)該是提取液中多種活性成分協(xié)同作用的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)為盤龍七的抗氧化活性成分的深入開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

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