GeneXpert MTB/RIF快速檢測(cè)在肺結(jié)核患者診斷中的應(yīng)用價(jià)值

鐘 莉，許 鎧

(云南省紅河州第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南蒙自 661199)

我國(guó)是全球范圍內(nèi)的22個(gè)肺結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，每年肺結(jié)核發(fā)病率居第3位[1]，肺結(jié)核患者的早診斷對(duì)預(yù)防肺結(jié)核傳播及提高治療效果有積極意義，傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)診斷方法包括痰涂片顯微鏡檢查、結(jié)核分枝桿菌(MTB)固體培養(yǎng)。涂片抗酸染色顯微鏡檢查至少需要每毫升含10 000個(gè)抗酸菌的標(biāo)本才能檢出，靈敏度低，并且不能區(qū)分MTB和非MTB；MTB固體培養(yǎng)方法耗時(shí)長(zhǎng)，不能有效滿足早診斷、早治療的要求。2010年WHO推薦Xpert MTB/RIF系統(tǒng)用于結(jié)核病的快速診斷和MTB對(duì)利福平的耐藥性檢測(cè)[2]，這種檢測(cè)方法靈敏度高，可以準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出利福平耐藥基因(ropB突變基因)，成為結(jié)核病檢查的重要方法之一。本研究對(duì)肺結(jié)核患者和疑似肺結(jié)核患者的標(biāo)本采用了Xpert MTB/RIF快速檢測(cè)、抗酸染色、全血γ-干擾素釋放試驗(yàn)、血清結(jié)核桿菌IgG檢測(cè)，旨在評(píng)價(jià)Xpert MTB/RIF快速檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2016年9月至2018年12月在本院就診并住院的肺結(jié)核和疑似肺結(jié)核患者共106例納入研究，上述人群均送檢了Xpert MTB/RIF、抗酸染色、全血γ-干擾素釋放試驗(yàn)、血清結(jié)核桿菌IgG檢測(cè)4個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目；男性77例，年齡14～79歲；女性29例，年齡17～83歲。106例患者的出院診斷顯示，31例為肺結(jié)核復(fù)治患者，這些患者均有肺結(jié)核病史，曾進(jìn)行抗肺結(jié)核治療；7例患者為AIDS合并肺結(jié)核，其中2例有肺結(jié)核既往史，3例患者Xpert MTB/RIF檢測(cè)為MTB陽(yáng)性且CT影像提示肺結(jié)核，2例患者CT提示為陳舊性肺結(jié)核經(jīng)抗肺結(jié)核治療好后好轉(zhuǎn)；其余68例為肺結(jié)核及其他診斷的患者，CT均有疑似肺結(jié)核的影像，患者均有肺結(jié)核的臨床癥狀。

1.2儀器與試劑 主要的儀器包括GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)賽沛公司)、酶標(biāo)儀(安圖公司)、二級(jí)生物安全柜；主要的試劑包括MTB rpoB基因和突變檢測(cè)試劑盒采用賽沛公司配套試劑；結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司；結(jié)核桿菌IGg抗體試劑購(gòu)自英科新創(chuàng)(廈門(mén))科技有限公司產(chǎn)品；抗酸染色液(冷染法)購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1晨痰標(biāo)本Xpert MTB/RIF快速檢測(cè) 把樣品消化液(消化液和痰液按2∶1的比例)加入盛有痰標(biāo)本中痰杯內(nèi)(要求患者晨痰標(biāo)本合格，不少于2 mL，理想的標(biāo)本量應(yīng)為3～4 mL，用同一份標(biāo)本做抗酸染色)，視痰標(biāo)本的黏稠度調(diào)整處理液的加入量，蓋上痰杯蓋子，在振蕩器上振蕩15～30 s，室溫靜置10 min，再次振蕩15～30 s，室溫靜置5 min，樣品在測(cè)試之前應(yīng)完全液化，無(wú)肉眼可見(jiàn)的痰塊。取2 mL處理好的樣品至反應(yīng)盒中，然后將反應(yīng)盒置于檢測(cè)模塊，儀器開(kāi)始自動(dòng)檢測(cè)，檢測(cè)耗時(shí)1 h 50 min，MTB檢測(cè)結(jié)果以高、中、低、極低和未檢出5個(gè)量級(jí)來(lái)表示，利福平耐藥基因結(jié)果以檢出和未檢出表示。

1.3.2抗酸染色 按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[3]中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作，結(jié)果以1+、2+、3+、4+和陰性表示。

1.3.3全血γ-干擾素釋放試驗(yàn) 采集患者的空腹靜脈血，置于肝素鈉抗凝管中，嚴(yán)格按照MTB特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果以陽(yáng)性或陰性報(bào)告。

1.3.4結(jié)核桿菌IgG抗體檢測(cè) 采用結(jié)核桿菌IgG抗體檢測(cè)試劑盒(膠體金法)進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，結(jié)果以陽(yáng)性或陰性報(bào)告。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，陽(yáng)性檢出率的比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.14種方法檢測(cè)患者痰標(biāo)本 Xpert MTB/RIF高于抗酸染色、結(jié)核桿菌IgG抗體檢測(cè)的陽(yáng)性率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=41.86、34.92，P<0.05)，與γ-干擾素釋放試驗(yàn)陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.024，P>0.05)，見(jiàn)表1。4種方法檢測(cè)都為陽(yáng)性的患者有13例。

表1 4種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率(n=106)

注：與Xpert MTB/RIF比較，*P<0.05

2.2Xpert MTB/RIF檢測(cè)基因突變 106例患者晨痰標(biāo)本檢出14例rpoB基因突變，耐藥率為19.18%(14/106)。8例探針位點(diǎn)為ProbeD，6例為ProbeE。

2.3Xpert MTB/RIF與抗酸染色結(jié)果的分析 Xpert MTB/RIF檢測(cè)為MTB高量級(jí)的8例患者抗酸染色均為陽(yáng)性；MTB中量級(jí)的37例患者中，抗酸染色陽(yáng)性15例；15例MTB低量級(jí)的患者中，抗酸染色陽(yáng)性2例；13例MTB極低量級(jí)的患者中，抗酸染色陽(yáng)性1例；33例未檢出MTB的患者抗酸染色均陰性。Xpert MTB/RIF與抗酸染色的檢測(cè)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=41.86，P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 Xpert MTB/RIF與抗酸染色比較

3 討 論

Xpert MTB/RIF是可同時(shí)進(jìn)行MTB及利福平耐藥性檢測(cè)的自動(dòng)化、全封閉檢驗(yàn)平臺(tái)。近年來(lái)，該技術(shù)被用于臨床分離株、痰液標(biāo)本及少數(shù)肺外結(jié)核標(biāo)本MTB及利福平耐藥性的檢測(cè)，多項(xiàng)研究證實(shí)其具有靈敏度與特異度高，生物安全性好、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，成為WHO推薦的藥敏感性分子檢測(cè)技術(shù)[4-6]。

Xpert MTB/RIF快速檢測(cè)MTB的半定量結(jié)果分為高、中、低、極低、未檢出5個(gè)級(jí)別。本研究檢出的8例MTB高量級(jí)標(biāo)本抗酸染色均為陽(yáng)性，抗酸染色結(jié)果為2+～3+；檢出的37例MTB中量級(jí)標(biāo)本中，抗酸染色陽(yáng)性15例(占40.55%)，抗酸染色結(jié)果均為1+；低和極低量級(jí)標(biāo)本，抗酸染色陽(yáng)性檢出率很低，分別是2例和1例，抗酸染色結(jié)果均為1+，說(shuō)明Xpert MTB/RIF檢測(cè)的量級(jí)結(jié)果與標(biāo)本中MTB數(shù)量呈正相關(guān)，抗酸染色方法結(jié)果也可能與標(biāo)本中MTB數(shù)量呈正相關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]。樣本中MTB數(shù)量很低的時(shí)候抗酸染色(直接涂片法)很可能鏡檢找不到，MTB中量級(jí)標(biāo)本如果標(biāo)本處理不當(dāng)或標(biāo)本質(zhì)量欠佳時(shí)抗酸染色(直接涂片法)鏡檢就可能漏檢。Xpert MTB/RIF 快速檢測(cè)在這些患者的臨床診治中有較高的靈敏度和特異度，與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果也基本一致[7-9]。

中國(guó)是耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，尤其是耐多藥結(jié)核病，是目前臨床工作中遇到的重大挑戰(zhàn)和主要障礙[10]，根據(jù)WHO報(bào)道，80%以上對(duì)利福平耐藥的結(jié)核病患者同時(shí)對(duì)異煙肼耐藥，即絕大多數(shù)對(duì)利福平耐藥的結(jié)核病患者為耐多藥結(jié)核病患者。Xpert MTB/RIF可檢測(cè)利福平耐藥基因，盡早發(fā)現(xiàn)結(jié)核感染與耐藥結(jié)核，可以為治療與治愈結(jié)核創(chuàng)造機(jī)會(huì)。Xpert MTB/RIF快速檢測(cè)技術(shù)還可以用于腦脊液、關(guān)節(jié)液、胃液、組織等肺外標(biāo)本的檢測(cè)[11-12]。

Xpert MTB/RIF核酸檢測(cè)方法采用GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)，是一種半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR體外診斷技術(shù)，以rpoB基因?yàn)榘谢颍詣?dòng)提取DNA后擴(kuò)增rpoB基因的192 bp片段進(jìn)行檢測(cè)，采用3種特異的引物和6種分子信標(biāo)，同時(shí)檢測(cè)6種探針，其中5個(gè)相互重疊的分子探針(分別以探針A～E命名)選擇性覆蓋rpoB基因的81 bp核心區(qū)，用于檢測(cè)利福平耐藥。

Xpert MTB/RIF技術(shù)由于檢測(cè)費(fèi)用高，推廣普及有一定困難，不能夠檢測(cè)非MTB，不能區(qū)分死菌和活菌[13]，另外Xpert Mtb/RIF只能檢測(cè)一種藥物耐藥基因，檢測(cè)結(jié)果受一些特殊的利福平耐藥相關(guān)基因突變的影響，例如耐多藥菌株由于含有rpoB1491F突變而不能被檢測(cè)出[14]。也有研究表明，rpoB533區(qū)的亮氨酸變?yōu)楦彼峥蓪?dǎo)致假陰性的出現(xiàn)[15]。

γ-干擾素釋放試驗(yàn)檢測(cè)需耗時(shí)20多小時(shí)，在肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者中的檢出率較高，優(yōu)于抗酸染色(直接涂片法)和結(jié)核桿菌IgG抗體檢測(cè)[16]，但不能檢測(cè)耐藥基因，不能將既往感染和活動(dòng)性肺結(jié)核進(jìn)行區(qū)分。結(jié)核桿菌IgG抗體檢測(cè)陽(yáng)性，有可能是由注射過(guò)卡介苗的交叉反應(yīng)導(dǎo)致。4種方法比較，Xpert MTB/RIF快速檢測(cè)的檢出率和指導(dǎo)治療的價(jià)值均較高，與趙冰等的研究結(jié)果相似[17-18]。

4 結(jié) 論

GeneXpert MTB/RIF快速檢測(cè)能提高菌含量少的痰液標(biāo)本或肺結(jié)核患者抗酸染色(直接涂片法)陰性標(biāo)本的MTB檢出率，能盡早發(fā)現(xiàn)耐藥結(jié)核菌，對(duì)肺結(jié)核的診斷和用藥指導(dǎo)優(yōu)于其他3種方法。