沉默GOLPH3基因表達逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌細胞順鉑耐藥的研究

王春曉，邱成志，洪鐘時

福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院普外科，福建 泉州 362000

中國結(jié)直腸癌每年新發(fā)病例約37.5萬，每年死亡病例約19.1萬［1］，其死亡率的變化趨勢有性別及年齡差異，男性居民呈上升趨勢，女性居民呈小幅度下降趨勢；高年齡組居民死亡率呈上升趨勢［2］。由于結(jié)直腸癌發(fā)病隱匿的特點再加上健康體檢的不到位，60%～70%的患者在確診時已經(jīng)處于中晚期［3］，因此，輔助化學治療仍是結(jié)直腸癌重要的治療措施。以鉑類和氟尿嘧啶為基礎的FOLFOX方案是目前結(jié)直腸癌的一線用藥。但化療過程中易產(chǎn)生化療耐藥，因此，研究結(jié)直腸癌的化療耐藥相關機制并逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥至關重要。

近年來研究表明，高爾基磷酸化蛋白3（Golgi phosphoprotein 3，GOLPH3）基因可促進癌細胞的生長、增殖并抑制凋亡，是一種新的原癌基因［4-5］，本實驗采用siRNA干擾技術，探討沉默GOLPH3基因逆轉(zhuǎn)HT29結(jié)腸癌細胞對順鉑的耐藥機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及細胞株

人結(jié)腸癌細胞株HT29購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，TRIzol、SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄酶購自立陶宛Fermentus公司，SYBR Ex Taq試劑盒購自日本Takara公司，siRNA靶向GOLPH3（GCUUGCUUAAUCATGGTTAT）購自上海吉瑪制藥技術有限公司，Opti-MEM購自上海拓然生物科技有限公司，四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購自美國Sigma公司，BCA蛋白定量試劑盒購自上海偉進生物科技有限公司，兔抗人GOLPH3多克隆抗體購自英國Abcam公司（ab98023），兔抗人P-gp單克隆抗體購自英國Abcam公司（ab170904)），ERK1/2購自英國Abcam公司（ab17942），pERK1/2購自英國Abcam公司（ab201015），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體購自南京碧云天生物技術有限公司（A0208），聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物根據(jù)基因全序列設計并由上海生工生物工程有限公司合成，細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinases，ERK）1/2抑制劑PD98059購自美國Cell Signaling Technology公司（9900S），順鉑購自齊魯制藥有限公司，GOLPH3購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將HT29人結(jié)腸癌細胞培養(yǎng)在RPMI-1640+10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的培養(yǎng)基中，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、95%飽和濕度環(huán)境的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2.2 細胞分組

將結(jié)腸癌細胞分為5組。①對照組：HT29細胞；②轉(zhuǎn)染組：用siRNA-GOLPH3轉(zhuǎn)染的HT29細胞組（采用脂質(zhì)體法，參照說明書用50 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染HT29細胞）；③實驗組1：順鉑處理后的HT29細胞組；④實驗組2：順鉑處理后的siRNA-GOLPH3轉(zhuǎn)染細胞組；⑤實驗組3：順鉑和ERK1/2抑制劑PD98059（濃度為50 μmol/L）處理后的HT29細胞組。各實驗組細胞均在含10 μmol/L順鉑的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24 h。

1.2.3 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）檢測結(jié)腸癌細胞株HT29轉(zhuǎn)染前后GOLPH3 mRNA的表達

用RT FQ-PCR檢測對照組及轉(zhuǎn)染組的GOLPH3 mRNA的表達。用TRIzol裂解法提取結(jié)腸癌細胞株總RNA，溶于適量RNase-free的超純水中，用分光光度計檢測R NA濃度。將R N A 反轉(zhuǎn)錄為c DNA，以GAPDH作為內(nèi)參，進行RT FQ-PCR。G OL PH 3上游引物：5'-AGGGCGACTCCA AGGA A A-3'，下游引物：5'-TGATGTGTAACCCTCGCG-3'，產(chǎn)物長度：83bp；18 Sr RNA 上游引物：5'-GGTCATAAGCTTGCGTTGATTAAG-3'，下游引物：5'-CTACGGAAACCTTGTTAC GACTTT-3'，產(chǎn)物長度：189 bp。反應條件：95 ℃預變性20 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共循環(huán)45次，在退火階段檢測熒光；融解曲線條件為50 ℃ 15 s，51 ℃升溫至99 ℃，每升高1 ℃停留5 s；數(shù)據(jù)分析通過相對定量-ΔΔCT法進行。

1.2.4 MTT法檢測各組細胞增殖

各組細胞經(jīng)胰酶消化后，接種于96孔板上，每孔加100 μL（1×105個細胞），貼壁培養(yǎng)24 h后每組設4個復孔及對照孔，對照孔僅加入細胞不做處理。培養(yǎng)48 h后，每孔加5 mg/mL的MTT 10 μL培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液。每孔加二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL，避光振蕩混勻，結(jié)晶溶解后用酶標儀檢測波長490 nm處的吸光度（D）值，以上步驟重復3次，取平均值。

1.2.5 克隆形成實驗檢測各組細胞增殖能力

①血球計數(shù)板計數(shù)細胞，6孔板的每個孔各接種不同處理類型的細胞1 000個；②每3 d換液1次，根據(jù)細胞種類不同，持續(xù)2周；③經(jīng)常觀察，待克隆長到肉眼可見，終止培養(yǎng)，PBS清洗1次；④甲醇固定20 min，PBS洗2遍；⑤0.5%結(jié)晶紫染液染色20 min；⑥PBS清洗3次，拍照計數(shù)；⑦以上步驟重復3次，取平均值。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測各組細胞株GOLPH3、P-gp、ERK1/2、pERK1/2等蛋白質(zhì)的水平

將處于對數(shù)生長期的各組細胞，用PBS清洗1次，再將細胞溶解在RIPA裂解緩沖液中，在冰上作用20 min。用BCA法測定蛋白濃度，分別利用細胞裂解液提取的細胞總蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE），電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉60 min，分別加入一抗GOLPH3、P-gp、ERK1/2、pERK1/2，4 ℃溫育過夜；PBST漂洗20 min×3次；加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗溶液，室溫溫育1 h；PBST漂洗10 min×3次；ECL化學發(fā)光試劑檢測。圖像應用Image-J軟件進行灰度分析，目的蛋白表達的相對強度=目的條帶的灰度值/GAPDH條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 HT29結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)染效果

2.1.1 siRNA-GOLPH3有效沉默人結(jié)腸癌細胞HT29中GOLPH3基因的表達

對照組HT29細胞GOLPH3 mRNA相對表達量為1.002±0.223，而轉(zhuǎn)染組的GOLPH3 mRNA相對表達量為0.162±0.062，轉(zhuǎn)染組較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；對照組和轉(zhuǎn)染組中的GOLPH3蛋白相對表達量分別為1.003±0.094和0.099±0.112，轉(zhuǎn)染組較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖1）。

圖1 對照組與轉(zhuǎn)染組中的GOLPH3 mRNA表達和蛋白水平Fig.1 The expression levels of GOLPH3 mRNA and protein in the control and transfection groups

2.1.2 HT29細胞轉(zhuǎn)染siRNA-GOLPH3后增殖及克隆形成能力均顯著降低

MTT法檢測HT29細胞增殖顯示，轉(zhuǎn)染組細胞的D490值為0.715±0.074，對照組D490值為1.007±0.130，轉(zhuǎn)染組顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組的集落數(shù)為341.700±54.930，對照組的細胞集落數(shù)為463.300±43.020，轉(zhuǎn)染組顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 對照組與轉(zhuǎn)染組癌細胞增殖與克隆形成能力Fig.2 The proliferation and colony formation capability of cancer cells in the transfection group and the control group

2.2 沉默GOLPH3基因表達可提高順鉑抑制HT29結(jié)腸癌細胞增殖與克隆形成能力

MTT法檢測對照組、實驗組1和實驗組2中細胞的D490值分別為1.000±0.127、0.746±0.085和0.236±0.071，實驗組1和實驗組2的D490值均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.001），同時，實驗組2的D490值顯著低于實驗組1，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）?？寺⌒纬蓪嶒烇@示，對照組、實驗組1和實驗組2細胞的集落數(shù)分別為604.700±39.700、442.300±34.270和126.300±45.650，實驗組1和實驗組2的細胞集落數(shù)均顯著低于對照組的細胞集落數(shù)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.001），同時，實驗組2的細胞集落數(shù)顯著低于實驗組1的細胞集落數(shù)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖3）。

2.3 沉默GOLPH3基因表達逆轉(zhuǎn)HT29細胞對順鉑化療耐藥的機制

2.3.1 沉默GOLPH3基因表達可下調(diào)pERK1/2的表達而抑制絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK）信號通路

在順鉑處理下，實驗組2的GOLPH3、P-gp的蛋白表達量分別為0.249±0.084、1.842±0.383，而實驗組1的GOLPH3、P-gp的蛋白表達量分別為2.734±0.440、4.269±0.454，實驗組2的GOLPH3、P-gp的蛋白表達量較實驗組1均同步顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；同時，ERK1/2蛋白在實驗組1、2及對照組均無顯著差異，而實驗組2的pERK1/2表達量為1.124±0.410，顯著低于實驗組1的4.353±0.956，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖4，表1）。

2.3.2 阻斷MAPK/ERK信號通路后可逆轉(zhuǎn)HT29結(jié)腸癌細胞對順鉑的耐藥

在上述實驗基礎上，順鉑處理并采用MAPK/ERK信號通路阻滯劑（PD98059），實驗組3中P-gp的蛋白相對表達量為1.525±0.189，比實驗組1的3.430±0.335顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖5）。

圖3 實驗組1、實驗組2及對照組癌細胞增殖與克隆形成能力Fig.3 The proliferation and colony formation capability of cancer cells in experimental group 1,experimental group 2 and the control group

圖4 順鉑處理下對照組、實驗組1和實驗組2細胞相關蛋白的表達Fig.4 Expression levels of the related proteins in the control group,experimental group 1 and experimental group 2 with cisplatin treatment

表1 對照組、實驗組1和實驗組2中相關蛋白的相對表達量Tab.1 The relative expression levels of related proteins in the control group,experimental group 1 and experimental group 2

圖5 順鉑處理下對照組、實驗組1和實驗組3中P-gp蛋白表達Fig.5 Expression level of P-gp protein in the control group,experimental group 1 and experimental group 3 with cisplatin treatment

3 討 論

順鉑作為鉑類化療藥物的代表，癌細胞對其耐藥仍是臨床難題，其機制包括多方面［6］，如基因表達異常等。GOLPH3基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的癌基因，定位于5p13上，編碼高爾基體復合物的一種約34×103的相關蛋白質(zhì)。研究表明，人結(jié)直腸癌組織中GOLPH3蛋白存在過表達，與細胞分化差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期晚、增殖等呈正相關，與凋亡呈負相關，與結(jié)直腸癌組織血管生成有關，可激活Wnt細胞信號轉(zhuǎn)導通路［7-10］。因此本研究旨在探討GOLPH3基因表達促進結(jié)腸癌細胞對順鉑的耐藥。

本研究顯示，在順鉑處理下，HT29結(jié)腸癌細胞沉默GOLPH3基因表達后，其癌細胞的增殖和克隆形成能力明顯抑制，說明GOLPH3基因參與HT29細胞的化療耐藥，表明下調(diào)GOLPH3基因表達可提高HT29結(jié)腸癌細胞對順鉑化療的敏感性。這可能與GOLPH3基因高表達可激活PI3K/AKT/mTOR和Wnt/β-catenin細胞內(nèi)信號通路有關，這些信號通路下游靶基因如MDR1、MRP1、c-myc等可參與癌細胞對鉑類化療藥物耐藥［11-14］。同時有研究證實，非小細胞肺癌對順鉑耐藥與PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路的異常活化有關［15］。GOLPH3基因高表達是否存在激活其他細胞信號通路如MAPK/ERK參與順鉑化療的耐藥，有待進一步研究。

已有研究報道，MAPK/ERK1/2信號通路過度激活與許多腫瘤對鉑類耐藥性的產(chǎn)生存在明顯的相關性，其作用機制可能是通過調(diào)控耐藥相關基因和蛋白如P-gp的表達［16］。P-gp是由多藥耐藥基因編碼的一種跨膜糖蛋白，是細胞產(chǎn)生多藥耐藥的分子基礎［17］。李敏等［18］的研究表明，白頭翁皂苷B4能逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥細胞（LoVo/L-OHP）對奧沙利鉑的耐藥，其機制可能與降低P-gp表達有關。

本研究證實，在順鉑處理下，下調(diào)結(jié)腸癌細胞GOLPH3表達，P-gp、pERK1/2蛋白表達量同步明顯下降，而阻滯MAPK/ERK信號通路活性，可顯著降低HT29細胞P-gp蛋白表達，表明GOLPH3基因高表達促進HT29細胞對順鉑的化療耐藥與激活MAPK/ERK信號通路相關，沉默GOLPH3基因表達能在一定程度上逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌細胞對順鉑的耐藥。這主要是GOLPH3基因能引起ERK1/2磷酸化，上調(diào)P-gp的表達而產(chǎn)生耐藥性。

綜上所述，沉默GOLPH3基因的表達可在一定程度上通過抑制MAPK/ERK信號通路活性逆轉(zhuǎn)HT29結(jié)腸癌細胞對順鉑的化療耐藥。