TLR4基因敲除小鼠對噪聲性耳蝸損傷的反應(yīng)

楊衛(wèi)平 許陽 胡博華 楊仕明

1 解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，耳鼻咽喉研究所（北京100853）2 解放軍總醫(yī)院呼吸科（北京100853）3 美國紐約州立布法羅大學(xué)聽力及聾病研究中心(NY 14214 USA）

強噪聲暴露引起耳蝸損傷，導(dǎo)致聽覺功能障礙。噪聲暴露后耳蝸免疫系統(tǒng)被激活，產(chǎn)生炎性介質(zhì)和免疫細胞滲入[1-4]。然而，耳蝸免疫激活的分子機制尚不清楚。本課題組前期采用RNA序列分析技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露后大鼠、小鼠耳蝸感覺神經(jīng)上皮主要表達相同的基因包括免疫應(yīng)答、創(chuàng)傷、防護、趨化和炎性反應(yīng)等基因，及趨化因子、NOD 樣受體、Toll 樣受體（Toll-like receptor, TLR）等信號通路基因[5]。

TLR 家族共有13 個成員，主要承擔(dān)識別感染性疾病中“病原體相關(guān)分子模式”(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)和非感染性疾病中壞死的細胞釋放“損傷相關(guān)的分子模式”（damage associated-molecular paternals, DAMPs）因子，TLR與相應(yīng)的配體相結(jié)合后通過級聯(lián)信號傳導(dǎo)引起細胞免疫炎癥反應(yīng)[6,7]。Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是Toll樣受體家族中的成員，是固有免疫系統(tǒng)中最重要的致炎信號通路之一，主要分布于免疫細胞和具有免疫功能的細胞[8]。TLR4 與配體結(jié)合后啟動相關(guān)通路，導(dǎo)致多種炎性因子的釋放[9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)TLR4 蛋白表達于內(nèi)耳細胞，噪聲暴露后內(nèi)耳細胞TLR4 蛋白表達增強[10]。本實驗選用TLR4 基因敲除(TLR4 KO)小鼠，觀察Toll 樣受體4 缺失小鼠耳蝸對噪聲刺激的反應(yīng)，分析其作用的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗采用C57BL/6J 小鼠（野生型,WT,對照組）和B6.B10ScN-Tlr4lps-del/JthJ 小鼠（TLR4 基因敲除型,TLR4 KO，實驗組）4～5周齡，雌雄各半，購自杰克遜實驗室(Jackson Laboratory, Bar Harbor,ME,USA）。小鼠的使用得到美國布法羅大學(xué)實驗動物中心的許可。

1.2 實驗步驟

首先檢測小鼠聽功能，篩選對照組動物，評估實驗組動物聽力學(xué)基線。噪聲暴露后1天,CO2麻醉后動物斷頭處死（每組各4 只)，觀察CD45 標記的噪聲暴露后小鼠耳蝸基底膜鼓階面巨噬細胞及單核細胞形態(tài)的變化。噪聲暴露后25 天，聽功能檢測（每組各7只)后動物處死，鬼筆環(huán)肽染色耳蝸基底膜毛細胞絲狀肌動蛋白，計數(shù)耳蝸基底膜缺失的外毛細胞。

1.3 聽功能檢測

使用美國TDT 測聽設(shè)備（Alachua,FL,USA)檢測小鼠ABR閾值。聽功能檢測在屏蔽的隔聲間內(nèi)進行。噪聲暴露后25 天，腹腔注射氯胺酮（87mg/kg）和賽拉嗪（3mg/kg）麻醉動物，將成功麻醉后的小鼠置于保溫毯上保持恒定體溫。記錄電極放置于小鼠顱頂皮下，參考電極放置于小鼠測試耳的耳后皮下，接地電極放置于小鼠非測試耳的耳后皮下。四個頻率(4kHz、8kHz、16kHz 和32 kHz) 的短純音誘發(fā)小鼠兩耳ABR 閾值，重復(fù)率為21 次/秒。帶通濾波為100～3000Hz，疊加次數(shù)為1024次。刺激的強度從100 dB SPL 開始，以5 dB 間隔遞減至ABR圖形的消失，重復(fù)最低dB測試的ABR圖形。

1.4 噪聲暴露

將美國TDT RP2.1 信號發(fā)生器（TDT, USA)、PA5 信號衰減器(TDT, USA)和美國Crown XLS 202信號放大器(Harman International Company,USA)發(fā)出的噪聲信號傳至美國NSD2005-8 擴音器(Eminence,USA)。選用寬帶1-7kHz，強度120dB SPL的強噪聲對WT 和TLR4 KO 實驗組小鼠持續(xù)噪聲暴露1小時。噪聲暴露過程在隔聲室內(nèi)進行，將小鼠放置于小鐵籠內(nèi)，擴音器懸掛于鼠籠之上。噪聲暴露前，使用美國LD-PCB,model 800B聲級計(APCB Piezotronics Div., Larson Davis,USA)、LD-PCB model 825 前置放大器( Larson Davis, USA)和Larson and Davis電容式微音器(LDL 2559,USA)校準噪聲暴露區(qū)域聲場的強度。

1.5 耳蝸毛細胞絲狀肌動蛋白染色

噪聲暴露前和噪聲暴露后25 天，聽功能檢測后處死動物，解剖取出雙側(cè)耳蝸。自圓窗緩慢注入10%福爾馬林液，室溫固定耳蝸組織4小時。采用本項目組建立的原位耳蝸基底膜毛細胞絲狀肌動蛋白染色觀察法[10]，染色評估強噪聲暴露后耳蝸毛細胞形態(tài)學(xué)的變化。

1.6 免疫細胞的熒光標記

采用免疫細胞的CD45 熒光標記方法染色小鼠耳蝸基底膜[3]。噪聲暴露前和噪聲暴露后1 天，解剖取出小鼠雙側(cè)耳蝸，將固定后分離的耳蝸基底膜移入10 mM PBS 稀釋的免疫熒光蛋白CD45一抗液中(goat CD 45 polyclonal antibody 1:200,AF114, RD Inc., USA) 4°C 孵育過夜。PBS 液清洗后將耳蝸基底膜移入PBS 稀釋的Fluor?488 二抗液中(Alexa Fluor?488 donkey anti-goat IgG, 1:200,Invitrogen)室溫孵育2h。PBS液清洗后將標本置入10mM PBS 配制的5μg/ml 碘化丙錠(propidium lodide, Molecular probe, OR, USA) 液中，室溫避光染色10min，抗熒光退變劑(ProlongTM Antifade kit,Molecular Probes Inc.USA)封片。

1.7 顯微鏡觀察及圖像處理

使用Leica 熒光顯微鏡(Z6 APO Manual Macro-Fluo,USA)觀察Alexa Fluor 488 鬼筆環(huán)肽染色的耳蝸基底膜毛細胞和CD45 熒光免疫抗體標記的耳蝸基底膜鼓階面的組織巨噬細胞和單核細胞。利用SPOT RT顯微鏡配制的相機(Color Diagnostic Instruments, MI, USA)依次拍照全耳蝸基底膜，采用Adobe Photoshop CS6 計算機圖像處理軟件(version 13.0.1, San Jose, CA, USA) 將連續(xù)拍照的圖像合圖。觀察噪聲暴露后1 天耳蝸基底膜鼓階面組織巨噬細胞和單核細胞形態(tài)變化，噪聲暴露后25 天耳蝸基底膜毛細胞形態(tài)變化，計數(shù)全耳蝸基底膜圖像中缺失的外毛細胞。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用美國SigmaStat Version3.5軟件處理，各組數(shù)據(jù)以±s表示。比較噪聲暴露前WT和TLR4 KO小鼠四個頻率ABR閾值，及噪聲暴露后25 天兩組小鼠ABR 閾移，采用兩因素方差分析。比較噪聲暴露前及噪聲暴露后25天兩組小鼠全耳蝸基底膜外毛細胞缺失數(shù)目，采用t檢驗分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生理條件下Toll 樣受體4 基因敲除沒有影響小鼠耳蝸基底膜感覺細胞的生存

熒光顯微鏡下觀察，Alexa 488-labeled 鬼筆環(huán)肽染色的生理條件下WT 和TLR4 KO 小鼠耳蝸基底膜毛細胞結(jié)構(gòu)正常，偶見毛細胞缺失（見圖1A和B)。比較WT（14.3±3.4)與TLR4 KO（15.3±3.9)小鼠全耳蝸缺失外毛細胞數(shù)目無顯著性差異（t 檢驗，P=0.578,見圖1C)。

圖1 Alexa 488-labeled 鬼筆環(huán)肽染色的生理條件下TLR4 KO 小鼠耳蝸毛細胞。A:耳蝸頂回毛細胞；B:耳蝸底回毛細胞；C:生理條件下WT 和TLR4 KO 小鼠全耳蝸外毛細胞缺失數(shù)目；標尺=100 μm。Fig.1 Typical image of F-actin staining in hair cells in the cochlea of TLR4 KO mice under physiological conditions. A:Hair cells in an apical section of cochlea.B:Hair cells in the basal section of cochlea. C: Comparison of the average numbers of missing outer hair cells between WT and TLR4 KO mice under physiological conditions.Bar=100 μm.

2.2 噪聲暴露后TLR4 KO小鼠聽功能下降幅度小于WT小鼠

噪聲暴露前檢測TLR4 KO 與WT 小鼠聽功能正常，兩組動物ABR 閾值無顯著性差異(F=0.126,df=1,100,P= 0.724； Tukey test,P＞0.05)，見圖2A 所示。噪聲暴露后25 天聽功能檢測發(fā)現(xiàn)，四個頻率短純音誘發(fā)的TLR4 KO小鼠ABR閾移均明顯低于WT 小鼠對照組(F=71.590,df=1,90,P＜0.001；Tukey test,P＜0.001)，見圖2B所示。

圖2 噪聲暴露前后WT 和TLR4 KO 小鼠聽功能變化。A:噪聲暴露前WT 和TLR4 KO 小鼠四個頻率短純音誘發(fā)的ABR閾值；B:噪聲暴露后25天兩組小鼠ABR閾移。Fig. 2 Comparison of auditory function between WT and TLR4 KO mice before and after noise exposure.A: Comparison of ABR thresholds at the 4 tested frequencies between WT and TLR4 KO mice before noise exposure. B: Comparison of ABR threshold shifts at the 4 tested frequencies between WT and TLR4 KO mice after noise exposure 25 days.*：P＜0.05,**：P＜0.01,***：P＜0.001.

2.3 噪聲暴露后TLR4 KO 小鼠耳蝸外毛細胞損傷程度輕于WT小鼠

熒光顯微鏡下觀察，鬼筆環(huán)肽染色的強噪聲暴露后兩組小鼠耳蝸基底膜頂回外毛細胞損傷程度較輕（見圖3A 和C），耳蝸底回為外毛細胞缺失的主要部位（見圖3 B和D）。兩組動物耳蝸缺失的外毛細胞數(shù)目比較顯示，噪聲暴露后25 天TLR4 KO小鼠全耳蝸基底膜外毛細胞缺失數(shù)目明顯少于WT小鼠對照組(圖3E，F(xiàn)=8.996, df =1, 17,P=0.008；Tukey test,P=0.008)。

圖3 噪聲暴露后25 天WT 與TLR4 KO 小鼠全耳蝸外毛細胞缺失數(shù)目。A-D:鬼筆環(huán)肽染色的小鼠耳蝸基底膜毛細胞；A:WT 小鼠耳蝸頂回毛細胞；B：WT 小鼠耳蝸底回毛細胞；C:TLR4 KO 小鼠耳蝸頂回毛細胞；D：TLR4 KO 小鼠耳蝸底回毛細胞；箭頭示缺失的外毛細胞區(qū)域，Apical:耳蝸基底膜頂回，Basal:耳蝸基底膜底回,標尺=100 μm；E:噪聲暴露后25天WT與TLR4 KO小鼠耳蝸基底膜外毛細胞缺失數(shù)目比較圖，TLR4 KO 小鼠耳蝸基底膜外毛細胞缺失數(shù)目明顯少WT對照組(P=0.008)。Fig. 3 Comparison of the number of missing OHCs at 25 days after noise exposure between WT and TLR4 KO mice cochlea.A-D: Typical images of F-actin staining in hair cells in the basilar membrane of mice cochlea.A:Typical image of F-actin staining in hair cells in the apical section of WT mice cochlea. B: Typical image of F-actin staining in hair cells in the basal section of WT mice cochlea. C: Typical image of F-actin staining in hair cells in the apical section of TLR4 KO mice cochlea. D: Typical image of F-actin staining in hair cells in the basal section of TLR4 KO mice cochlea. Arrows point to the areas of missing OHCs. Bar = 100 μm. E: Comparison of the number of missing OHCs after noise exposure between WT and TLR4 KO mice cochlea. The average number of missing OHCs in theTLR4 KO mice cochlea is significantly less than in the WT mice cochlea.**：P＜0.01.

2.4 TLR4基因缺失沒有阻止噪聲暴露后單核細胞滲入耳蝸

在生理條件下，WT 和TLR4 KO 小鼠耳蝸頂回和底回基底膜鼓階面可見CD45染色陽性的巨噬細胞(多形型，F(xiàn)ig.4 A,C,E,G)。噪聲暴露后1天，兩組小鼠耳蝸基底膜頂回和底回巨噬細胞形態(tài)無明顯變化（Fig.4 B,D,F,H),但在兩組小鼠耳蝸底回基底膜與外側(cè)壁連接處均可見CD45染色陽性的單核細胞（小圓型，F(xiàn)ig.4 F和H），表明TLR4基因缺失沒有阻止噪聲暴露后單核細胞浸入耳蝸基底膜。

圖4 噪聲暴露前后WT和TLR4 KO小鼠耳蝸基底膜鼓階面CD45 標記的組織巨噬細胞和單核細胞。A 和C:噪聲暴露前WT 和TLR4 KO 小鼠耳蝸頂回的組織巨噬細胞； E 和G:噪聲暴露前WT 和TLR4 KO 小鼠耳蝸底回的組織巨噬細胞；B和D:噪聲暴露后1天WT和TLR4 KO小鼠耳蝸頂回的組織巨噬細胞；F和H:噪聲暴露后1天WT和TLR4 KO小鼠耳蝸底回的組織巨噬細胞和單核細胞；單箭頭示典型的組織巨噬細胞，雙箭頭示典型的單核細胞，Pre-noise:噪聲暴露前，1d post-noise:噪聲暴露后1天，Apical:耳蝸基底膜頂回，Basal:耳蝸基底膜底回，標尺=40μm。Fig.4 Typical morphology of tissue macrophages and monocytes stained with CD45 in the cochlear basilar membrane of before and 1day after noise exposure. A and C: Morphology of tissue macrophages in the apical section of WT and TLR4 KO mice cochlea before noise exposure. E and G: Morphology of tissue macrophages in the basal section of WT and TLR4 KO mice cochlea before noise exposure.B and D:Morphology of tissue macrophages in the apical section of WT and TLR4 KO mice cochlea 1 day after noise exposure.F and H: Morphology of tissue macrophages and monocytes in the basal section of WT and TLR4 KO mice cochlea 1 day after noise exposure.Arrows point to the typical morphology of tissue macrophages.Double arrows point to the typical morphology of monocytes.Bar=40 μm.

3 討論

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，耳蝸基底膜鼓階面存在固有組織巨噬細胞，暴露后1天出現(xiàn)單核細胞浸入耳蝸基底膜[3]。本實驗檢測暴露后1天TLR4 KO小鼠耳蝸基底膜免疫細胞形態(tài)變化，目的揭示TLR4基因缺失是否影響單核細胞浸入耳蝸基底膜。暴露后25天檢測外毛細胞的數(shù)量，目的是評估TLR4基因缺對耳蝸外毛細胞形態(tài)的作用。我們對WT和TLR4 KO小鼠耳蝸外毛細胞計數(shù)及ABR閾值檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生理情況下TLR4 基因敲除并未影響小鼠耳蝸毛細胞形態(tài)和聽覺功能，表明TLR4 基因與正常聽覺功能無關(guān)。暴露后1 天，WT 和TLR4 KO 小鼠均出現(xiàn)耳蝸基底膜單核細胞的浸潤,表明TLR4基因敲除并未影響噪聲暴露后血液中單核細胞向耳蝸基底膜鼓階面的浸潤。

本實驗的主要目的為揭示TLR4基因敲除對噪聲性耳蝸感覺細胞損傷、聽覺功能障礙和耳蝸免疫活力的影響。采用TLR4 KO小鼠模型，以WT小鼠為對照，觀察強噪聲暴露后25 天耳蝸外毛細胞缺失數(shù)目和ABR 閾值的變化。發(fā)現(xiàn)強噪聲暴露后，TLR4基因敲除減少噪聲暴露后小鼠耳蝸外毛細胞死亡數(shù)量，減輕聽功能損傷程度，表明TLR4參與了噪聲暴露后耳蝸外毛細胞的損傷，其可能機制：

高強度噪聲暴露后耳蝸毛細胞的機械性損傷繼發(fā)代謝性損傷和免疫炎性反應(yīng)[11]。耳蝸外毛細胞對強噪聲性耳蝸損傷最為敏感，強噪聲暴露后耳蝸外毛細胞主要以凋亡和壞死方式死亡[12]，細胞凋亡是噪聲性耳蝸毛細胞死亡的主要方式[13]。凋亡細胞由于細胞內(nèi)溶酶體膜完整，死亡后被吞噬細胞吞噬，很難造成周圍細胞的損傷[14]。壞死細胞內(nèi)溶酶體膜破裂，釋放大量多種酸性的水解酶，造成壞死細胞的自溶和周圍細胞的炎性反應(yīng)[15]。同時，壞死的細胞釋放多種DAMPs 因子，DAMPs 與固有免疫功能細胞上的“模式識別受體”（pattern recognition receptors，PRRs）結(jié)合，進而激活固有免疫系統(tǒng)，直接或間接啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答[16]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，高強度噪聲致耳蝸毛細胞的死亡發(fā)生在噪聲暴露后數(shù)分鐘內(nèi)[12]，并可延續(xù)至噪聲暴露后30天[13]，表明強噪聲暴露后耳蝸毛細胞存在明顯的次級損傷。因此，本實驗選擇觀察強噪聲暴露后25 天TLR4 基因敲除小鼠耳蝸毛細胞形態(tài)和聽覺功能的變化。本課題組前期研究證實，本實驗采用的噪聲暴露條件（寬帶1-7kHz、120dB SPL、噪聲暴露1 小時）能造成小鼠聽功能障礙，出現(xiàn)永久性聽力閾移(permanent threshold shift,PTS)[17]。

我們的前期實驗發(fā)現(xiàn)，TLR4 蛋白表達在耳蝸感覺神經(jīng)上皮中毛細胞臨近的支持細胞，噪聲暴露后1 天過表達的TLR4 集中在死亡毛細胞周圍的Deiters 細胞[10]。另有研究報道，TLR4 表達在耳蝸柯蒂氏器與外側(cè)壁螺旋韌帶之間的外溝細胞[18]。本實驗形態(tài)學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露后TLR4 KO 小鼠耳蝸基底膜外毛細胞損傷程度明顯輕于WT 對照小鼠，結(jié)合噪聲暴露后TLR4 蛋白過表達于死亡毛細胞周圍的檢測結(jié)果，我們認為TLR4 促進噪聲性耳蝸毛細胞的損傷。

能夠與TLR4 相結(jié)合的DAMPs 主要有熱休克蛋白(HSPs)、高遷移率族蛋白1(HMGB1)、組蛋白(Histones)、S100 蛋白(S100s)等[7]。有研究報道，強噪聲暴露后4 小時小鼠耳蝸組織HSP 的表達量為未接觸噪聲暴露小鼠的20余倍[19]。作為DAMPs之一的HSP 能與耳蝸免疫功能細胞膜上TLR4 相結(jié)合，激活免疫功能細胞，誘導(dǎo)促炎因子的產(chǎn)生。本實驗采用免疫細胞熒光抗體CD45 染色耳蝸基底膜發(fā)現(xiàn),噪聲暴露后1天TLR4 KO 和WT小鼠耳蝸基底膜底回均出現(xiàn)單核細胞浸入。我們的前期實驗證明，噪聲暴露后4 天，浸入耳蝸基底膜的單核細胞開始轉(zhuǎn)化為巨噬細胞[3]。從時間上分析，噪聲暴露后早期TLR4 參與的耳蝸免疫反應(yīng)主要由耳蝸基底膜固有組織巨噬細胞和免疫功能細胞執(zhí)行。

參與耳蝸免疫反應(yīng)的細胞主要包括免疫細胞如巨噬細胞（固有型和游走型）、單核細胞[3]，和具有免疫功能的非免疫細胞如：柯蒂氏器的支持細胞、外側(cè)壁的纖維細胞和耳蝸基底膜鼓階面的間皮細胞[1]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，柯蒂氏器中的支持細胞是產(chǎn)生炎性因子的一個重要來源[10]，螺旋韌帶的纖維細胞產(chǎn)生多種炎性因子[20-21]。噪聲暴露后TLR4 與配體結(jié)合激活免疫功能細胞，激活的免疫功能細胞釋放炎性因子，導(dǎo)致耳蝸細胞的炎性反應(yīng)和聽功能的下降。本實驗噪聲暴露后TLR4 KO小鼠耳蝸外毛細胞缺失數(shù)量減少，聽功能下降程度減輕，表明TLR4的缺失對噪聲性耳蝸毛細胞損傷起到了一定的防護作用。

總之，本文發(fā)現(xiàn)TLR4 缺失減輕噪聲暴露后耳蝸基底膜外毛細胞的損傷，表明TLR4 促進噪聲暴露后耳蝸的炎性反應(yīng)。我們認為噪聲機械性耳蝸毛細胞壞死導(dǎo)致DAMPs 的釋放，DAMPs 與耳蝸具有免疫功能的支持細胞和纖維細胞膜上的TLR4結(jié)合，激活免疫功能細胞，誘導(dǎo)促炎因子的釋放，導(dǎo)致耳蝸細胞免疫炎性反應(yīng)。TLR4的缺失部分阻斷炎癥過程，降低促炎因子的表達，減輕噪聲暴露后耳蝸感覺細胞和聽功能損傷的程度。TLR4作為啟動機體先天性免疫應(yīng)答的開關(guān)，在噪聲性耳蝸損傷中起著重要的作用。然而，噪聲暴露后耳蝸死亡的細胞釋放哪些DAMPs? TLR4 與DAMPs 結(jié)合后釋放哪些促炎因子？促炎因子如何作用到毛細胞？諸多問題有待于進一步研究揭示。深入探討TLR4在噪聲性耳蝸損傷的免疫炎性機制，將成為臨床早期干預(yù)的研究方向。