燈盞花素改善胰島素抵抗作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

閆方艷 李錦平 武莉 馮吉波

摘要：目的 ?基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討燈盞花素和胰島素抵抗相關(guān)靶點(diǎn)之間的相互作用及其作用機(jī)制。方法 ?通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）結(jié)合文獻(xiàn)挖掘確定燈盞花素的主要活性成分，多個(gè)數(shù)據(jù)庫聯(lián)用檢索和篩選活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，并通過SystemsDock web site對其進(jìn)行對接驗(yàn)證，利用DAVID數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)生物功能及相關(guān)通路進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果 ?經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索及文獻(xiàn)查證，燈盞花素主要活性成分為燈盞乙素，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選出與胰島素抵抗治療密切相關(guān)的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)4個(gè)（NOS3、PTPN1、ADORA1、PRKCG），參與代謝調(diào)控、炎癥反應(yīng)和有機(jī)氮化合物代謝等生物過程，通過干預(yù)PI3K-Akt、Ras、Insulin resistance和HIF-1等相關(guān)通路發(fā)揮抗胰島素抵抗作用。結(jié)論 ?燈盞花素可能通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮改善胰島素抵抗的作用，為深入開展其作用機(jī)制研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);燈盞花素;胰島素抵抗;作用機(jī)制;分子對接

中圖分類號(hào)：R259.87;R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2019）11-0085-05

Abstract： Objective To probe into the interaction between breviscapine and targets associated with insulin resistance and its mechanism based on network pharmacology. Methods The main active components of breviscapine were determined by TCMSP databases and literature mining. Multiple databases were used to search and screen the corresponding targets of active components. The active components-target-disease network was constructed and its docking verification was conducted through the SystemsDock web site. The targets biological functions and related pathways were analyzed by DAVID. Results Verified by the database retrieval and literature， scutellarin was reported to be the main active component of breviscapine. Network topology analysis identified four potential key targets closely related to insulin resistance therapy （including NOS3， PTPN1， ADORA1， and PRKCG）， participating in biological processes such as metabolic regulation， inflammatory reaction， metabolism of organic nitrogen compounds. Anti-insulin resistance was exerted by intervention of related signaling pathways such as PI3K-Akt， Ras， insulin resistance and HIF-1. Conclusion Breviscapine may improve the role of insulin resistance through multiple targets and pathways， which can provide a scientific basis for further research on its mechanism.

Keywords： network pharmacology; breviscapine; insulin resistance; mechanism; molecular docking

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是指組織器官或組織細(xì)胞對胰島素的生物調(diào)節(jié)作用不敏感或無反應(yīng)而導(dǎo)致正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)，是心血管疾病相關(guān)的糖尿病、冠心病、肥胖、高脂血癥等代謝性疾病的共同核心關(guān)鍵因素[1-2]，改善IR對心血管疾病的防治具有極其重要的意義。IR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種因素的相互作用、相互影響且大多具有多基因相關(guān)性，使用單一靶點(diǎn)的藥物無法實(shí)現(xiàn)對IR的有效控制，由此，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究具有重要意義[3-6]。

燈盞花素（breviscapine）是燈盞花經(jīng)醇提后的總黃酮成分，具有抗氧化、抗血栓、保護(hù)腦組織等廣泛的藥理作用，臨床用于腦血栓、心絞痛、動(dòng)脈硬化等缺血性心腦血管疾病及糖尿病的治療[7]，已有研究表明，燈盞花素能調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂，增強(qiáng)胰島素敏感性，對IR有一定療效[8-9]，但其具體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確。鑒于IR發(fā)生機(jī)制的復(fù)雜性及燈盞花素作用的廣泛性，推測燈盞花素的作用具有多靶點(diǎn)可能性，為進(jìn)一步探討燈盞花素改善IR的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，借助靶點(diǎn)預(yù)測、分子對接等技術(shù)，通過構(gòu)建燈盞花素活性成分與IR相關(guān)靶點(diǎn)之間的多層次作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合其改善疾病的主要通路，在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的層面綜合分析燈盞花素改善IR的作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)，并為臨床用藥提供依據(jù)。

1 ?資料與方法

1.1 ?藥物活性成分確定及潛在靶點(diǎn)篩選

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，http//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）、中藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫（http：//cowork.cintcm.com/engine/ search？channelid=58730），獲取已報(bào)道的燈盞花素化學(xué)成分，進(jìn)一步查閱相關(guān)文獻(xiàn)，確定燈盞花素主要活性成分。

經(jīng)TCMSP獲取活性分子的毒藥物動(dòng)力學(xué)（ADME）性質(zhì)，即對其口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）進(jìn)行評估（OB≥2.64%、DL≥0.79），利用Pubchem數(shù)據(jù)庫（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）結(jié)合文獻(xiàn)挖掘?qū)Ψ肿咏Y(jié)構(gòu)進(jìn)行確證。

采用反向藥效團(tuán)對接（PharmMapper，http：//59.78.96.61/pharmmapper/）、藥物相似性搜索（STITCH，http：//stitch.embl.de/）、GeneCards（https：// www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫預(yù)測和篩選活性分子對應(yīng)靶點(diǎn)，去除重復(fù)和假陽性靶點(diǎn)基因，得到燈盞花素改善IR的潛在靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.2 ?疾病靶點(diǎn)篩選

通過Cytoscape3.6.1軟件的DisGeNET插件搜索與IR相關(guān)的靶點(diǎn)基因，其數(shù)據(jù)來源包括人類基因和基因表型綜合數(shù)據(jù)庫（OMIM）、國際遺傳藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（PharmGkb）、毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫（CTD，http：//ctdbase.org/）等多個(gè)數(shù)據(jù)庫，可靠性較高[10]。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)資料進(jìn)行篩選驗(yàn)證，去除重復(fù)數(shù)據(jù)，得到IR相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.3 ?網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將上述得到的不規(guī)范的靶點(diǎn)名稱通過UniProt數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）整理靶點(diǎn)基因名，去掉重復(fù)項(xiàng)，用于后續(xù)分析。以藥物活性成分、成分對應(yīng)靶點(diǎn)、藥物相關(guān)疾病、IR相關(guān)靶點(diǎn)四者為節(jié)點(diǎn)，建立對應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-疾病，網(wǎng)絡(luò)并利用其插件Network Analyzer進(jìn)行分析[11]，觀察藥物與疾病靶點(diǎn)的相互作用情況，以確定其潛在關(guān)鍵作用靶標(biāo)。

1.4 ?分子對接驗(yàn)證

分子對接技術(shù)是確認(rèn)分子與靶點(diǎn)有效作用的途徑[12-13]，通過UniProt數(shù)據(jù)庫獲取所得潛在關(guān)鍵靶標(biāo)X射線晶體結(jié)構(gòu)的PDB編號(hào)，利用SystemsDock web site（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/ index）[14]對關(guān)鍵靶標(biāo)與燈盞花素的活性成分進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，用以評價(jià)活性小分子與靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性。

1.5 ?生物學(xué)過程和信號(hào)通路富集分析

將得到的活性分子靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO（gene ontology）生物學(xué)過程[15]和KEGG通路富集分析，再通過CTD數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)查閱，以閾值P<0.05篩選整合排名靠前的生物學(xué)過程或通路。

2 ?結(jié)果

2.1 ?藥物活性成分及靶點(diǎn)

通過TCMSP、Pubchem等數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)挖掘確定燈盞花素主要成分為燈盞乙素（Scutellarin）和少量燈盞甲素，燈盞乙素是其主要活性單體，含量>95%，對其進(jìn)行ADME計(jì)算發(fā)現(xiàn)，燈盞乙素的OB值較低，需要大劑量多次給藥，提示在制劑開發(fā)中需要注意劑型選擇問題。此外，由于本實(shí)驗(yàn)要求目標(biāo)化合物須為中藥中的活性成分，故對燈盞甲素不做深入研究。

基于預(yù)測軟件及專業(yè)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研，去重后得到燈盞乙素潛在作用靶點(diǎn)121個(gè)，篩選驗(yàn)證后得到與燈盞花素改善IR可能的相關(guān)作用靶點(diǎn)42個(gè)，檢索到與IR相關(guān)的靶點(diǎn)基因222個(gè)，最終匹配得到靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集69個(gè)。

2.2 ?網(wǎng)絡(luò)可視化分析

通過對所構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)的分析，可得網(wǎng)絡(luò)的一般特征及對藥物治療疾病作用機(jī)制的初步認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步探索與藥物、疾病相關(guān)的作用途徑[11，16]。燈盞花素活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)見圖1。

該網(wǎng)絡(luò)共包含121個(gè)節(jié)點(diǎn)和132條邊線，網(wǎng)絡(luò)密度（network density）、網(wǎng)絡(luò)中心度（network centralization）、網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性（network heterogeneity）分別為0.017、0.567、3.823，不同顏色的節(jié)點(diǎn)分別代表藥物活性成分、靶點(diǎn)和相關(guān)疾病，邊線表示各節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，選擇度和介數(shù)均大于平均值的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵作用靶點(diǎn)（見表1），提示燈盞花素可能通過這些靶點(diǎn)具有潛在的改善IR的作用。

2.3 ?分子對接

將所得潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)的PDB編號(hào)導(dǎo)入SystemsDock web site并與燈盞花素活性成分進(jìn)行對接，結(jié)果見表2。此對接方法所得分?jǐn)?shù)是實(shí)驗(yàn)解離/抑制常數(shù)值的負(fù)對數(shù)（pKd/pKi），通常為0～10（即從弱到強(qiáng)結(jié)合），允許直接指示結(jié)合強(qiáng)度。通常認(rèn)為，對接打分>4.25說明分子與靶點(diǎn)之間有一定的結(jié)合活性，>5.0說明分子與靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性，>7.0說明分子與靶點(diǎn)具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[14，17]。對接結(jié)果顯示，燈盞乙素與靶點(diǎn)的對接分?jǐn)?shù)均介于5.0～7.0，表明燈盞花素活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性。另外，經(jīng)文獻(xiàn)查證，上述重要靶點(diǎn)在IR的發(fā)生發(fā)展過程中均存在直接或間接的關(guān)系，說明該研究方法具有一定的科學(xué)性。

2.4 ?主要生物學(xué)過程

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對燈盞花素的活性成分燈盞乙素對應(yīng)靶點(diǎn)的生物功能進(jìn)行分析，并以P<0.05篩選整合排名靠前的生物學(xué)過程，富集度較高的前20個(gè)生物學(xué)過程見表3。燈盞花素的靶點(diǎn)基因大多富集在細(xì)胞凋亡及分化的調(diào)節(jié)、代謝過程調(diào)控、對缺氧的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)過程、有機(jī)氮化合物代謝等過程中。

2.5 ?主要信號(hào)通路

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對燈盞乙素對應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，借助Omicshare云平臺(tái)（http：//www.omicshare.com/）對排名靠前的通路進(jìn)行整合繪制，按P值由小到大排列的前20條信號(hào)通路見圖2?？梢钥闯?，根據(jù)P<0.05的要求，燈盞花素主要參與VEGF、HIF-1、PI3K-Akt、Ras等信號(hào)通路，涉及其他通路有花生四烯酸代謝、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE通路等，其中PI3K-Akt、Insulin resistance、Ras、HIF-1信號(hào)通路與IR的發(fā)生密切相關(guān)，這表明燈盞花素作用靶點(diǎn)分布于不同的代謝通路，相互協(xié)調(diào)、共同調(diào)節(jié)是其改善IR的可能作用機(jī)制。

3 ?討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建了燈盞花素改善IR的活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，分析了藥物成分、靶點(diǎn)與疾病之間的相互作用關(guān)系，并對活性分子與其潛在關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行了對接打分、GO生物學(xué)過程和KEGG通路富集分析。富集分析結(jié)果顯示：燈盞花素通過調(diào)控細(xì)胞代謝、炎癥反應(yīng)等生物過程在細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器等部位發(fā)揮離子/蛋白/信號(hào)受體結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性激活等分子功能;富集所得通路中，PI3K-Akt、Ras、Insulin resistance等信號(hào)通路與IR的發(fā)生及治療密切相關(guān)，此外還得到與癌癥、細(xì)胞增殖與凋亡等相關(guān)的通路。

網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，NOS3、PTPN1、ADORA1、PRKCG在燈盞花素改善IR作用中起重要作用。研究表明，NOS3基因是IR發(fā)生的基因標(biāo)志之一，藥物通過PI3K途徑增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)水平，調(diào)節(jié)胰島素受體后信號(hào)分子的異常，從而減輕細(xì)胞等組織的IR[18];胰島素信號(hào)傳導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)因子PTP1B編碼基因PTPN1參與胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控，其通過IRS1的酪氨酸殘基去磷酸化作用干預(yù)PI3K-Akt信號(hào)通路，從而對胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)[19-20];在Western diet高脂小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，ADORA1缺失會(huì)加重非酒精性脂肪肝和IR，促進(jìn)肥胖的產(chǎn)生[21]。由此可見，IR的發(fā)生發(fā)展與這些關(guān)鍵靶點(diǎn)可能存在直接或間接聯(lián)系，而燈盞花素改善IR可能涉及多個(gè)過程和通路的協(xié)同作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道的燈盞花素具有廣泛藥理活性相一致。

上述研究結(jié)果盡管體現(xiàn)了燈盞花素多靶點(diǎn)、多通路改善IR的作用特點(diǎn)，但因目前有關(guān)燈盞花素改善IR作用機(jī)制研究報(bào)道較少，加之網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有關(guān)疾病和藥物數(shù)據(jù)庫信息資源的局限性，使文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可能與數(shù)據(jù)庫實(shí)際收錄信息存在偏差，隨著科研不斷深入及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的進(jìn)步，與疾病治療和藥物作用相關(guān)的新靶點(diǎn)將不斷被發(fā)現(xiàn)。此外，燈盞花素作為一類中藥單體具有廣泛的藥理作用及臨床應(yīng)用，其作用靶點(diǎn)之間是否具有相似性還未可知，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)行研究，可預(yù)測藥物可能的作用靶點(diǎn)及作用途徑，較全面地進(jìn)行作用機(jī)制分析，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康男?，減少實(shí)驗(yàn)資源的消耗，為進(jìn)一步開展燈盞花素改善IR的實(shí)驗(yàn)研究及臨床新用途的研究與開發(fā)提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] ZIMMET P， MAGLIANO D， MATSUZAWA Y， et al. The metabolic syndrome：a global public health problem and a new definition[J]. J Atheroscler Thromb，2005，12（6）：295-300.

[2] BIDDINGER S B， KAHN C R. From mice to men：insights into the insulin resistance syndromes[J]. Annu Rev physiol，2006，68：123- 158.

[3] HOPKINS A L. Network pharmacology：The next paradigm in drug discovery[J]. Nat Chem Bio，2008，4（11）：682-690.

[4] 趙靜，方海洋，張衛(wèi)東.中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中的生物信息學(xué)方法[J].藥學(xué)進(jìn)展，2014，38（2）：97-103.

[5] ZHANG S D， SHAN L， LI Q， et al. Systematic analysis of the multiple bioactivities of green tea through a network pharmacology approach[J]. Evid Based Complement Alternat Med， 2014，2014：512081.

[6] LI X， WU L， FAN X， et al. Network pharmacology study on major active compounds of Fufang Danshen formula[J]. China J Chin Mater Med，2011，36（21）：2911-2915.

[7] 王麗娟，王勇，李金鳴.燈盞花素對豚鼠心室肌細(xì)胞遲發(fā)性外向鉀電流的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2002，18（3）：326-328.

[8] ZHU B H， GUAN Y Y， HE H， et al. Erigeron breviaeapua prevents defective endothelium dependent relaxation in diabetic rat aorta[J]. Life Sci，1999，65（15）：1553.

[9] 劉舒凌，楊秀芬，王乃平.燈盞乙素改善地塞米松致大鼠胰島素抵抗的作用研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（7）：1678-1679.

[10] BAUER-MEHREN A， RAUTSCHKA M， SANZ F， et al. DisGeNET：a cytoscape plugin to visualize， integrate， search and analyze gene-disease networks[J]. Bioinformatics，2010，26（22）：2924-2926.

[11] BARABASI A L， GULBAHCE N， LOSCALZO J. Network medicine：a network-based approach to human disease[J]. Nat Rev Genet，2011， 12（1）：56-68.

[12] FANG J， LI Y， LIU R， et al. Discovery of multi-target-directed ligands against Alzheimer's disease through systematic prediction of chemical-protein interactions[J]. J Chem Inf Model， 2015，55（1）：149-164.

[13] 段愛霞，陳晶，劉宏德，等.分子對接方法的應(yīng)用與發(fā)展[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（4）：473-477.

[14] HSIN K Y， MATSUOKA Y， ASAI Y， et al. systemsDock：a web server for network pharmacology-based prediction and analysis[J]. Nucleic Acids Res，2016，44（W1）：W507-W513.

[15] Gene Ontology Consortium. The gene ontology project in 2008[J]. Nucleic Acids Res，2008，36：D440-D444.

[16] 張新莊，蕭偉，徐筱杰，等.利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究熱毒寧注射液抗流感病毒的分子作用機(jī)制[J].物理化學(xué)學(xué)報(bào)，2013，29（7）：1415-1420.

[17] HSIN K Y， GHOSH S， KITANO H. Combining machine learning systems and multiple docking simulation packages to improve docking prediction reliability for network pharmacology[J]. PLoS One， 2013，8（12）：e83922.

[18] YU Q， GAO F， MA X L. Insulin says NO to cardiovascular disease[J]. Cardiovasc Res，2011，89（3）：516-524.

[19] ELCHEBLY M， PAYETTE P， MICHALISZYN E， et al. Increased insulin sensitivity and obesity resistance in mice lacking the protein tyrosine phosphatase-1B gene[J]. Science，1999，283（5407）：1544- 1548.

[20] BAKKE J， HAJ F G. Protein-tyrosine phosphatase 1B substrates and metabolic regulation[J]. Semin Cell Dev Bol，2015，37：58-65.

[21] 楊萍.腺苷受體A1在肝臟疾病發(fā)病機(jī)制中的作用研究[D].南京：南京理工大學(xué)，2013.

（收稿日期：2018-12-16）

（修回日期：2019-02-12;編輯：陳靜）