丹參素-絲裂霉素C攣藥的制備及體外釋放研究·

陳卓 譚李玉 尤靜 張蕾

摘 ?????要： 為了降低高毒性藥物絲裂霉素C（MMC）在治療翼狀胬肉時(shí)的副作用，多靶點(diǎn)聯(lián)合抑制翼狀胬肉成纖維細(xì)胞，將其與具備抗成纖維細(xì)胞活性及血管保護(hù)作用的無(wú)毒藥物丹參素（DSS）化學(xué)偶聯(lián)為攣藥MMC-DSS。體外釋放研究表明，MMC-DSS可以積聚在眼表后逐漸釋放MMC與丹參素以產(chǎn)生活性。從而獲得了一種在翼狀胬肉治療中結(jié)膜血管副作用更低，且能夠多靶點(diǎn)產(chǎn)生藥效的全新攣藥。

關(guān) ?鍵 ?詞：丹參素;絲裂霉素C;攣藥;翼狀胬肉

中圖分類號(hào)：TQ 463 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ??????文章編號(hào)： 1671-0460（2019）03-0459-03

Abstract： In order to reduce the side effects of Mitomycin C in the treatment of pterygium， twindrug MMC-DSS was prepared by chemical coupling of Danshensu and MMC. Its release in vitro was studied. The results showed that the twindrug MMC-DSS could amass in ocular surface and then release the MMC and the Danshensu to generate multi-target activity. A reduction of side-effects of MMC in the treatment of pterygium was achieved by this new twindrug through its multi-target therapy.

Key words： Danshensu; Mitomycin C ; Twindrug; Pterygium

翼狀胬肉是一種當(dāng)結(jié)膜持續(xù)性受到紫外線、風(fēng)沙、霧霾等外界刺激后，在瞼裂部球結(jié)膜引起成纖維細(xì)胞增殖導(dǎo)致的贅生性病變。翼狀胬肉是高日照地區(qū)，如陜西、山西、內(nèi)蒙、寧夏、青海、新疆、西藏等地區(qū)常見(jiàn)的眼科疾病，長(zhǎng)期困擾著這些地區(qū)的群眾尤其是長(zhǎng)期戶外作業(yè)者。翼狀胬肉浸潤(rùn)角膜會(huì)導(dǎo)致散光，炎癥，甚至失明[1]。翼狀胬肉目前在眼科臨床主要依靠手術(shù)切除[2]，切除后眼表殘存的成纖維細(xì)胞具有很強(qiáng)的腫瘤樣特征，如果術(shù)中、術(shù)后不加干預(yù)，殘存的成纖維細(xì)胞會(huì)快速增殖，導(dǎo)致強(qiáng)復(fù)發(fā)[3]。因此，現(xiàn)行的臨床治療指南要求在手術(shù)切除翼狀胬肉組織以后在結(jié)膜施用絲裂霉素C（Mitomycin C ， MMC）來(lái)抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。但是，MMC的毒性較大，使用后會(huì)導(dǎo)致晶狀體、玻璃體及視網(wǎng)膜等受損[4]。尋找低毒性的成纖維細(xì)胞抑制藥物是目前翼狀胬肉治療中的重要任務(wù)。

丹參素（Danshensu，DSS）是中藥丹參（Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhiza）中的活性成分，在臨床上主要用于保護(hù)心、腦等臟器免收缺氧損傷[5]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，丹參素還具有抗成纖維細(xì)胞增生的作用[6]，其可以抑制肝星狀細(xì)胞的增生，從而預(yù)防免疫性肝纖維化[7]，可以抑制人腎成纖維細(xì)胞的增生并誘導(dǎo)其凋亡[8];在眼科的研究也發(fā)現(xiàn)，丹參素可以有效抑制眼成纖維細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，從而對(duì)眼部成纖維細(xì)胞增殖性疾病表現(xiàn)出良好的治療作用[9]。

本研究將絲裂霉素C與丹參素通過(guò)化學(xué)合成的方法制備為攣藥MMC-DSS（圖1），此攣藥有望具有以下三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：第一，使藥物在靶部位同時(shí)釋放絲裂霉素C及丹參素，兩者抑制成纖維細(xì)胞增殖的機(jī)理不同[4，9]，可以產(chǎn)生雙靶點(diǎn)協(xié)同作用，提高了藥效;第二，丹參素的分子結(jié)構(gòu)上除偶聯(lián)反應(yīng)使用的羧基外，還具有三個(gè)羥基，可以與水分子形成氫鍵，從而可以提高M(jìn)MC的水溶性，使之難以透過(guò)角膜[10]，積累在親水的結(jié)膜組織液中，隨時(shí)間慢慢在結(jié)膜組織中發(fā)生水解反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物為一分子絲裂霉素C與一分子丹參素，這樣既達(dá)到了靶向與翼狀胬肉組織的作用，又達(dá)到了隨水解反應(yīng)緩釋的效果;第三，丹參素對(duì)正常眼組織細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)低于抗癌藥物MMC，且具有血管保護(hù)作用[11]，兩者聯(lián)用可以在獲得同等藥效的前提下降低藥物的副作用。本文對(duì)所獲得的攣藥分子MMC-DSS還進(jìn)行了In Vitro drug release研究，發(fā)現(xiàn)其在人工淚液模擬的眼表環(huán)境下能夠呈零級(jí)緩慢釋放，這驗(yàn)證了我們對(duì)攣藥功能的設(shè)計(jì)，有望獲得一種新穎的翼狀胬肉治療藥物（圖1）。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?原料與試劑

絲裂霉素C純度為98+% （MCE中國(guó)）;丹參素鈉純度為98+% （ark pharm）;N-甲基嗎啉為分析純（上海阿拉丁生化科技）;N-羥基琥珀酰亞胺為分析純（安耐吉化學(xué)）;1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二酰亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）為分析純（安耐吉化學(xué)）;其他常見(jiàn)有機(jī)溶劑、試劑均為分析純，必要時(shí)干燥。

1.1.2 ?儀器

微量厚壁反應(yīng)瓶為V131003型（北京欣維爾玻璃儀器有限公司）;高效液相色譜儀為1260型（美國(guó)安捷倫公司）;磁力攪拌低溫槽為PSL-1810型（日本東京理化株式會(huì)社）。

1.2 ?MMC-DSS的制備研究

1.2.1 ?β-（3，4-二羥基苯基）乳酸N-羥基丁二酰亞胺酯（丹參素-NHS，化合物1）的制備向3 mL微量厚壁反應(yīng)瓶中加入丹參素鈉10.3 mg（46.8 μmol），EDC鹽酸鹽28.9 mg（151.3μmol）， N-羥基丁二酰亞胺5.8 mg（50.4 μmol），使用微量注射器加入100 μLN-甲基嗎啉，加入0.7 mL DMSO后，在攪拌下溶解，N2保護(hù)下室溫反應(yīng)24h，將反應(yīng)液倒入5 mL 2 N 鹽酸與10 mL二氯甲烷的混合液中，充分震蕩后分液，二氯甲烷層干燥后蒸干，得褐色油狀物 5.16 mg，收率37.4%， 因極不穩(wěn)定，不經(jīng)檢測(cè)直接用于下一步反應(yīng)，投料前充N(xiāo)2保存于-20 ℃。

1.2.2 β-（3，4-二羥基苯基）乳酸酰絲裂霉素C（MMC-DSS）的制備

向3 mL微量厚壁反應(yīng)瓶中加入β-（3，4-二羥基苯基）乳酸N-羥基丁二酰亞胺酯（丹參素-NHS，化合物1）3.2 mg（10.8 μmol），絲裂霉素C 3.6 mg（10.8 μmol）， 0.03 mol/L HBS緩沖液（pH為 7.4）2 mL，攪拌12 h，期間監(jiān)控反應(yīng)液pH，以微量注射器補(bǔ)充0.5 mol/L 氫氧化鈉水溶液維持pH=7.4，減壓蒸干反應(yīng)液，所得油狀物以硅膠柱色譜分離（氯仿：甲醇 100：1至10：1），得到黃色固體4.1 mg ，收率73.7%。經(jīng)核磁共振波譜法驗(yàn)證為目標(biāo)化合物MMC-DSS， 1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 8.89 （s， 1H）， 8.49 （s， 1H）， 6.65 （s， 1H）， 6.62 （d， J=8.0 Hz， 1H）， 6.48 （d， J=8.0 Hz， 1H）， 4.36 （m，2H）， 4.24 （d， J=10.2 Hz， 1H）， 3.76 （m， 2H）， 3.70 （s， 1H）， 3.11 （s， 3H）， 2.85（d， J=16.6 Hz， 1H）， 2.77（d， J=4.5 Hz， 1H）， 2.69（d， J=4.5 Hz， 1H）， 1.66 （s， 3H），1.16 （s， 1H）。

1.3 ?MMC-DSS的體外釋放研究

本研究參考了陳卓[12，13]所發(fā)表的絲裂霉素C前藥的體外釋放研究方法。取氯化鈉 6.78 g，氯化鉀 1.38 g，碳酸氫鈉 2.18 g加入1000 mL容量瓶中，加入約500 mL純化水溶解，取氯化鈣 0.084 g溶解于約200 mL純化水后攪拌下加入上述容量瓶中，定容即得人工淚液。以人工淚液5 mL為溶出介質(zhì)，向其中加入MMC-DSS 15 mg，控制釋放液溫度為（37±0.5）℃，控制攪拌子轉(zhuǎn)速為約60 r/min。從加入MMC-DSS開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔一定時(shí)間取釋放液0.2 mL并補(bǔ)加人工淚液0.2 mL，釋放液過(guò)濾后用HPLC測(cè)定其中絲裂霉素C的濃度。

絲裂霉素C測(cè)定的色譜條件為：安捷倫科技C18色譜柱（4.6 mm-150 mm-5μm），乙腈-磷酸緩沖液（15：85），流速1 mL/min，進(jìn)樣量20μL，柱溫37 ℃，測(cè)定波長(zhǎng)為365 nm。

2 結(jié)果與討論

攣藥MMC-DSS是將丹參素上的羧基與絲裂霉素C上的伯氨基成酰胺鍵。傳統(tǒng)的制酰胺工藝有酰氯法和直接縮合法，即將丹參素上的羧基制成酰氯再與氨基反應(yīng)或在DCC、DMAP體系下使丹參素的羧基直接與絲裂霉素C的氨基縮合。但是，丹參素的分子中既有羧基也有羥基，如果直接將丹參素與絲裂霉素C在DMAP/DCC、EDC等縮合劑存在的條件下成酰胺，或是將丹參素制備為酰氯再與絲裂霉素C成酰胺，其結(jié)果會(huì)導(dǎo)致丹參素自身分子間縮合成酯。為了避免這一情況，我們先將丹參素的羧基與N-羥基丁二酰亞胺縮合為不易與羥基反應(yīng)的丹參素活性酯（丹參素-NHS，化合物1），再與MMC上的伯氨基以酰胺鍵連接，從而以較少的副反應(yīng)和較簡(jiǎn)潔的步驟獲得了目標(biāo)化合物。

活性酯法相較酰氯法的優(yōu)勢(shì)還在于避免了丹參素的光學(xué)活性損失。天然丹參素具有手性，其手性碳為一個(gè)手性仲醇，在酰氯法所使用的酸性條件下非常容易發(fā)生消旋化[14]，導(dǎo)致產(chǎn)物的光學(xué)純度下降，而活性酯法則避免了酸性環(huán)境的使用，從而避免了這一問(wèn)題。

本研究使用了N-羥基丁二酰亞胺酯，即NHS活性酯，其優(yōu)點(diǎn)在于上述的避免酸性環(huán)境使用從而保護(hù)了丹參素的光學(xué)活性。然后NHS活性在使用過(guò)程中還需要注意一些問(wèn)題，否則將難以獲得所期望的產(chǎn)物。第一，NHS活性酯的穩(wěn)定性較差，一般在使用時(shí)采用原位制備的方式在獲得后不經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。這是因?yàn)槌Ｓ玫闹V法所采用的條件容易導(dǎo)致NHS活性酯水解，從而導(dǎo)致產(chǎn)物損失;第二，在獲得NHS活性酯后，應(yīng)當(dāng)將其保存在低溫冰箱中，并充氮?dú)獗４?，從而避免所攜帶的雜質(zhì)及空氣中的氧氣及水蒸氣對(duì)活性酯的影響。

本研究將絲裂霉素C與丹參素制備的攣藥MMC-DSS，經(jīng)體外釋放研究發(fā)現(xiàn)，其在人工淚液模擬的眼表環(huán)境下能夠呈零級(jí)緩慢釋放（表1），這驗(yàn)證了我們對(duì)攣藥功能的預(yù)期，即藥物在翼狀胬肉患處同時(shí)釋放絲裂霉素C及丹參素，兩者通過(guò)不同的抑制成纖維細(xì)胞增殖機(jī)理，可以產(chǎn)生雙靶點(diǎn)協(xié)同作用，提高藥效，驗(yàn)證了課題設(shè)計(jì)，有望獲得一種新穎的翼狀胬肉治療藥物。

本研究在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用了微量厚壁反應(yīng)瓶代替?zhèn)鹘y(tǒng)上使用的圓底燒瓶。微量厚壁反應(yīng)瓶具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：第一，相較于同體積的圓底燒瓶，由于其為細(xì)長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，液面更深，更有利于溫度計(jì)的探入測(cè)量，同時(shí)不容易因反應(yīng)液在攪拌中飛濺粘在瓶壁上從而影響反應(yīng)的進(jìn)行;第二，配合特制的瓶蓋后，因?yàn)槠浔诤瘢梢阅蛪?，可以適合于較高壓的反應(yīng)條件。這一點(diǎn)對(duì)反應(yīng)工藝研究是十分有利的，使反應(yīng)溫度的摸索可以不完全受溶劑沸點(diǎn)的限制。在研究中，我們可以利用反應(yīng)瓶耐壓的特點(diǎn)，將溫度升高至沸點(diǎn)后繼續(xù)升溫，這時(shí)由于內(nèi)部密閉耐壓，壓力會(huì)逐漸升高，沸點(diǎn)也隨之提高，可以使反應(yīng)液的溫度提高至溶劑沸點(diǎn)以上，從而探索在該溫度下反應(yīng)的情況。

3 結(jié) 論

設(shè)計(jì)并通過(guò)兩步反應(yīng)合成了雙靶點(diǎn)攣藥MMC-DSS。通過(guò)In Vitro drug release研究表明，其可以以前藥形式靶向于翼狀胬肉患處后逐漸釋放絲裂霉素C與丹參素以產(chǎn)生雙靶點(diǎn)活性，從而獲得了一種新穎的、有望降低副作用的潛在翼狀胬肉治療藥物。

參考文獻(xiàn)：

[1]孫振蕊，丁琳，閆璐，劉曉弟，沈丹妮.翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制及治療的現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2018，18（03）：577-580.

[2]王娟.翼狀胬肉不同手術(shù)方式對(duì)術(shù)后淚膜影響的研究進(jìn)展[J].國(guó)際眼科雜志，2018，18（01）：89-91.

[3]張雅冰，張曉俊.翼狀胬肉治療的現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2017，23（06）：1183-1186.

[4]楊成毅，劉明.復(fù)發(fā)性翼狀胬肉切除術(shù)中絲裂霉素C濃度的選擇研究[J].現(xiàn)代儀器與醫(yī)療，2018，24（01）：107-108+113.

[5]陳向榮，陸京伯，石漢平.丹參的藥理作用研究新進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2001（01）：44-45.

[6]陸新良，錢(qián)可大.丹參抗纖維化作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中華內(nèi)科雜志，2006（07）：608-610.

[7]鄭元義，戴立里，王文兵，賈麗萍，周賢.丹參素治療肝纖維化及其作用機(jī)制研究[J].中華肝臟病雜志，2003（05）：33-35.

[8]張國(guó)強(qiáng)，葉任高，孔慶瑜，李幼姬，關(guān)偉明.丹參對(duì)培養(yǎng)中狼瘡性腎炎成纖維細(xì)胞的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào)，1997（01）：19-21+64.

[9]張誠(chéng)玥，李根林.丹參干預(yù)成纖維細(xì)胞增生及其機(jī)制[J].眼科新進(jìn)展，2011，31（09）：833-836+845.

[10]宮崎順一，高野正彥，翁幗英.關(guān)于滴服劑的角膜透過(guò)性[J].南藥譯叢，1961（Z1）：39.

[11]馬敏. 丹參對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其組分丹參素的藥代動(dòng)力學(xué)研究[D].天津醫(yī)科大學(xué)，2004.

[12]陳卓，石蕊，譚李玉，張宇佳.DHA-絲裂霉素C偶聯(lián)前藥的制備及角膜透過(guò)性研究[J].中國(guó)油脂，2017，42（08）： 108-110+115.

[13]陳卓，石蕊，譚李玉，鄔莉娜，畢群杰，夏銳，張蕾.低分子量聚谷氨酸的制備及其在眼科靶向藥物中的應(yīng)用研究[J].當(dāng)代化工，2016，45（12）：2787-2789.

[14]胡珊珊. α-環(huán)己基扁桃酸的合成、拆分及消旋化[D].南京工業(yè)大學(xué)，2004.