超高效液相-質(zhì)譜法檢測嬰配奶粉中的肌醇含量

張成祥，曾祥恒*，付紅巖

1. 黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部（哈爾濱 150066）；2. 雅士利國際集團(tuán)有限公司（潮州 515638）

肌醇，學(xué)名環(huán)已六醇，廣泛存在于各種天然動(dòng)物、植物及微生物組織中，因最初由肌肉組織中提取，故得肌醇之名（又稱肌肉糖）。肌醇的分子式為C6H12O6，分子量為180.16。肌醇在動(dòng)物和植物代謝中很重要。研究表明肌醇含量與某些疾病的預(yù)防有關(guān)，如糖尿病、白內(nèi)障、腎病和人類神經(jīng)精神疾病。對(duì)于嬰幼兒來說，肌醇等選擇性添加營養(yǎng)素成為模擬母乳配方中常用的非強(qiáng)制性食品添加劑，對(duì)嬰兒早起發(fā)育有著至關(guān)重要的作用，其可促進(jìn)嬰兒毛發(fā)生長，為大腦提供營養(yǎng)，具有代謝脂肪及膽固醇等作用[1]。

近年來，關(guān)于肌醇含量的測定方法有很多種，但迄今都有或多或少的不足。如重量法和高碘酸鉀氧化法僅適合純品的檢測，而后者還需嚴(yán)格控制加熱氧化時(shí)間，否則結(jié)果誤差大。氣相色譜法[2-7]和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[8-11]均需進(jìn)行柱前衍生化，操作繁瑣。液相色譜法[12-17]采用示差檢測器進(jìn)行檢測，靈敏度低，選擇性差，僅適合高含量、基質(zhì)簡單的樣品的分析。超高效液相色譜[18-21]串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，選擇性強(qiáng)。試驗(yàn)旨在建立嬰幼兒配方奶粉中肌醇的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法。該方法簡單，快速，重現(xiàn)性好。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肌醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.5%，SIGMA公司）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.5%，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；果糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.7%，中國計(jì)量科學(xué)研究所）；乙醇（分析純）、氨水（分析純）、乙腈（色譜純），默克公司；超純水（由Mill-Q純水系統(tǒng)制得）；0.22 μm過濾膜（津騰公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀，配備質(zhì)譜檢測器QDA、恒溫柱及真空脫氣系統(tǒng)；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；IKA MS3 basic旋渦混勻器；HSIANGTAL CN-2060 臺(tái)式高速離心機(jī)；分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Mill-Q（IQ 7000）純水機(jī)。

1.3 色譜條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相，乙腈-0.1%氨水（75︰25，體積比）；流速，0.2 mL/min；柱溫，35 ℃；進(jìn)樣量，1 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測器：電噴霧電離源（ESI），負(fù)離子化模式，毛細(xì)管電壓0.8 V，錐孔電壓4 V，探頭溫度600 ℃，采集速率1 Hz，全掃描m/z 50～450，SIR質(zhì)量數(shù)見表1。

表1 單糖、肌醇和山梨醇的SIR

1.5 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配置

肌醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（500 μg/mL）：稱取50 mg（精確到0.01 mg）經(jīng)過105±1 ℃烘干2 h的肌醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL容量瓶中，用25 mL水溶解完全，用95%的乙醇定容至刻度，混勻。

肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液溶液：分別吸取0.5，1.0，2.0，4.0和8.0 mL肌醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（500 μg/mL）于50 mL容量瓶中，配置成質(zhì)量濃度為5，10，20，40和80 μg/mL的肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.6 樣品前處理

稱取0.5 g（精確至0.000 1 g）奶粉樣品到50 mL容量瓶中，加水5 mL溶解，超聲40 ℃提取10 min。加入無水乙醇定容。渦旋0.5 min后靜止20 min，取10 mL到15 mL離心管中，以6 000 r/min高速離心5 min。離心后，取上清液，經(jīng)過0.22 μm PTFE濾膜過濾到進(jìn)樣小瓶，制得待測的肌醇樣品測定液。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 沉淀劑濃度的選擇

按照1.6樣品前處理的方法進(jìn)行處理，除乙醇體積分?jǐn)?shù)外，其他條件不變，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別改為70%，75%，80%和95%，進(jìn)行上機(jī)測定。結(jié)果表明，在95%乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，出峰峰形最好，其他濃度下拖尾現(xiàn)象明顯，定量不準(zhǔn)確，所以選擇最佳沉淀劑濃度95%。

2.1.2 取樣量的選擇

按照1.6樣品前處理的方法進(jìn)行處理，除取樣量外，其他條件不變，取樣量分別改為0.5，1.0，1.5和2.0 g，進(jìn)行上機(jī)測定。結(jié)果表明，當(dāng)取樣量為0.5 g時(shí)，峰形最好，單位質(zhì)量的響應(yīng)值最高。所以選擇最佳取樣量0.5 g。

2.1.3 提取溫度的選擇

按照1.6樣品前處理的方法進(jìn)行處理，除提取溫度外，其他條件不變，提取溫度分別為30，40，50和60 ℃，進(jìn)行上機(jī)測定。結(jié)果表明，提取溫度在40 ℃以后，響應(yīng)值變化不明顯，所以選擇最佳提取溫度40 ℃。

2.1.4 提取時(shí)間的選擇

按照1.6樣品前處理的方法進(jìn)行處理，提取時(shí)間分別為5，10，20和30 min。結(jié)果表明，提取時(shí)間在10 min后響應(yīng)值無明顯變化，所以選取10 min為最佳提取時(shí)間。

2.1.5 沉淀劑的選擇

奶粉中含有大量蛋白質(zhì)等干擾物，想要準(zhǔn)確測定肌醇含量，沉淀劑的選擇很重要。經(jīng)過酸沉淀、乙腈沉淀、乙醇沉淀對(duì)比，結(jié)果表明當(dāng)使用酸沉淀奶粉中的蛋白時(shí)，在酸性條件下上機(jī)，響應(yīng)值極小。使用乙腈進(jìn)行沉淀，經(jīng)過測試，當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)，沉淀效果較好，但是回收率只有80%，只有乙醇沉淀回收率較好。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測器采用的是單四級(jí)桿，所以對(duì)錐孔電壓進(jìn)行了測試。根據(jù)儀器文獻(xiàn)，首先對(duì)糖類推薦的15 V錐孔電壓進(jìn)行了測試，得出響應(yīng)值之后對(duì)比其他數(shù)量的錐孔電壓響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)錐孔電壓為4 V時(shí)，響應(yīng)值最高。因此選用4 V錐孔電壓作為最優(yōu)條件。

流動(dòng)相的選擇，對(duì)比了甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.2%乙酸和乙腈-水（0.1%氨水），結(jié)果表明肌醇在酸性條件+H，SIR181.1條件下，不出峰。肌醇在堿性條件下-H，SIR179.2條件下，檢測結(jié)果較好。

如圖1所示，確定乙腈-水（0.1%氨水）作為流動(dòng)相后，對(duì)氨水濃度進(jìn)行優(yōu)化，分別進(jìn)行了0.05%，0.1%和0.2%濃度比較，結(jié)果表明當(dāng)濃度為0.1%時(shí)單位體積響應(yīng)值最高。

圖1 肌醇豐度圖

2.3 色譜條件優(yōu)化

經(jīng)質(zhì)譜條件篩選后選用乙腈-水（0.1%氨水）作為流動(dòng)相，色譜條件采用等度洗脫，對(duì)比梯度洗脫，等度洗脫更能節(jié)省上機(jī)時(shí)間，且梯度洗脫容易造成柱壓升高，堵塞色譜柱。

色譜柱的選擇，選用ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱，對(duì)比普遍的C18柱，肌醇檢測液是極性很強(qiáng)的化合物，C18柱不保留，對(duì)于硅膠正向色譜柱，流動(dòng)相不能有水。對(duì)于氨基柱，水流失快，容易污染質(zhì)譜。所以選用耐水耐酸堿較好的ACQUITY UPLC BEH Amide酰胺色譜柱，其能承受的pH范圍為1～11。

進(jìn)樣量的選擇，考察了0.5，1和2 μL進(jìn)樣量，結(jié)果表明當(dāng)進(jìn)樣量為1 μL時(shí)，單位體積響應(yīng)值最高。待條件確定好后，考察其色譜行為，結(jié)果表明肌醇在乙腈-水（0.1%氨水）為75︰25時(shí)，峰形理想，5 min內(nèi)完成分析。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的消除

超高效液相色譜質(zhì)譜檢測普遍存在樣品基質(zhì)效應(yīng)問題，特別是奶粉這種基質(zhì)復(fù)雜的產(chǎn)品，基質(zhì)效應(yīng)是難點(diǎn)，由于奶粉中本身具有肌醇，所以曾采用生本底的方法來消除基質(zhì)效應(yīng)，但是效果不理想。通過試驗(yàn)得出，針對(duì)奶粉來說，減小樣品取樣量能很好地消除基質(zhì)效應(yīng)，樣品取樣量減少到一定數(shù)量能夠準(zhǔn)確定量。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 鑒別試驗(yàn)

奶粉一般含有其他單糖等同分異構(gòu)體乳糖，因此在奶粉中可能含有由乳糖等多糖分解而成的葡萄糖等單糖，其中葡萄糖與肌醇是同分異構(gòu)體，在試驗(yàn)中需良好分離，才不會(huì)干擾肌醇的檢測。除葡萄糖以外還進(jìn)行了果糖和山梨醇的鑒別。經(jīng)試驗(yàn)，采用該方法的前處理和色譜條件，可以排除葡萄糖、果糖、山梨醇的干擾。全掃描方式色譜圖見圖2。在SIR181.1條件下，2.2 min僅有山梨醇出峰，其他物質(zhì)不出峰。在SIR215.1條件下，2.3 min葡萄糖、果糖出峰，其他物質(zhì)都不出峰。在SIR179.2條件下，3.5 min僅有肌醇出峰，結(jié)果表明在SIR179.2條件下肌醇無同分異構(gòu)體干擾。

圖2 肌醇鑒別色譜譜圖

2.5.2 方法的線性與范圍

根據(jù)1.5的方法配置肌醇標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，以肌醇標(biāo)準(zhǔn)物的定量離子峰面積之比y為縱坐標(biāo)，以肌醇標(biāo)準(zhǔn)體積濃度之比x為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，其線性關(guān)系和相對(duì)系數(shù)分為y=2.21e+004x+1.99e+004，R=0.999 96。試驗(yàn)表明，肌醇在5～80 μg/mL之間呈線性關(guān)系。肌醇標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

圖3 肌醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.3 儀器檢出限和方法檢出限

在上述條件下，以3倍基線噪聲水平所相當(dāng)?shù)拇郎y物質(zhì)的量計(jì)算，儀器的最低檢出限為0.12 μg/mL，由于樣品前處理過程稀釋了100倍，因此方法的檢出限為12 μg/100 g。

2.5.4 儀器精密度測試

將質(zhì)量濃度為20 μg/mL的肌醇標(biāo)準(zhǔn)液連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果見表2。結(jié)果表明RSD＜3，符合儀器檢測要求。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 方法精密度

用該方法對(duì)同一品種的嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行n=6的RSD計(jì)算，其檢測結(jié)果為80.1，82.0，80.6，81.3，81.9和81.5 mg/100 g；均值為81.2 mg/100 g，RSD= 0.92%，RSD＜5%，符合方法精密度要求。

2.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

對(duì)奶粉進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，稱取0.25 g（精確至0.000 1 g）奶粉樣品（n=9），每3個(gè)為一組，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為本底含量的50%，100%和150%的標(biāo)準(zhǔn)液到50 mL容量瓶中，按照1.6的方法進(jìn)行處理。加標(biāo)回收率結(jié)果如表3所示。該方法的添加回收率在94.8%～ 101.1%之間，滿足回收率90%～110%的要求，表明方法準(zhǔn)確度較好。

表3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了嬰兒配方粉中肌醇含量的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測法。樣品經(jīng)過水溶液提取，乙醇沉淀蛋白后，用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測。該方法前處理簡單、回收率穩(wěn)定、靈敏度高、定量準(zhǔn)確，并且所用試劑危害較小，可節(jié)約檢測成本，適用于嬰幼兒配方奶粉以及其他同類型產(chǎn)品中肌醇的檢測。