一測多評法測定甜蕎芽中5種酚類成分

彭鐮心 *，張艷紅，魏麗娟，劉婉瑩，宋盼盼，趙鋼

1. 成都中醫(yī)藥大學藥學院（成都 611130）；2. 成都大學藥學與生物工程學院（成都 610106）；3. 成都大學農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點實驗室（成都 610106）

蕎麥（Buckwheat）屬蓼科，主要栽培種有甜蕎（Fagopyrum esculentum Moench）和苦蕎（Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn），為一年生栽培植物。甜蕎營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量達8.5%～18.9%[1-2]，8種必需氨基酸組成更加均衡合理[3-4]；同時，甜蕎中有酚類、黃酮類、糖醇類、蛋白質(zhì)、多肽等活性成分，具有降血壓、降低毛細血管脆性、改善微循環(huán)、提高人體免疫力等方面的藥理功效[5-7]，發(fā)芽后蕎麥中蘆丁等酚類成分含量顯著增加[8]。

酚類成分是廣泛存在于植物界的一類具有多種生理功能的活性物質(zhì)，是植物性食物發(fā)揮保健功能性的主要物質(zhì)基礎[9-10]，被廣泛運用于醫(yī)學、食品、制革和日化等相關領域。甜蕎作為小宗雜糧，發(fā)芽后其活性成分大大增加，為了深度挖掘甜蕎的發(fā)展?jié)摿Γ瑧搶μ鹗w芽中的酚類成分進行相關分析。由于測定方法和對照品來源的限制，甜蕎芽中的酚類成分的定量大多采用紫外分光光度計比色法進行酚類成分的定量[11]，還沒有建立超高效液相測定甜蕎芽中酚類成分的方法，不能對甜蕎芽中各個酚類成分進行準確定量，在甜蕎芽的質(zhì)量控制上存在一定的限制。一測多評法通過計算待測成分間校正因子，可實現(xiàn)在只有一種對照品的情況下同時測定多種成分，已被廣泛應用于中藥材質(zhì)量評價中[12-13]。

試驗以7種甜蕎芽為研究對象，選擇蘆丁作為參照，即只測定蘆丁這一個成分，通過確定它與葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素之間的內(nèi)在函數(shù)關系，通過外標法和一測多評法得到7種甜蕎芽中各酚類成分的含量，驗證一測多評法在甜蕎芽的多指標成分質(zhì)量評價中的適用性，進而建立甜蕎芽中酚類成分質(zhì)量控制的方法，為甜蕎芽中酚類成分的測定提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

寧蕎1號、品甜2號、紅花甜蕎、赤甜1號、定甜3號、豐甜1號、寧甜1號（四川省金堂蕎麥基地）；葒草素對照品（批號：waq-16041301）、異葒草素對照品（批號：wak-16080404）、牡荊素對照品（批號：130522）、異牡荊素對照品（批號：wak-16082004）、蘆丁對照品（批號：wak-16031602）：純度均大于98%，四川維克奇生物科技有限公司；甲醇（色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?；冰乙酸（色譜純，成都市科龍化工試劑廠）；水（重蒸餾水）；其余試劑（均為分析純）。

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀（QSM四元泵、SM-FTN進樣器、CH-A柱溫箱、PDA檢測器：沃特世上?？萍加邢薰荆?；FD-2真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有點公司）；CP 224 C十萬分之一電子分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；KQ 5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；H 2050 R高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 甜蕎芽的制備

挑選顆粒飽滿、大小均一的甜蕎粒，清洗、除雜，在純凈水中浸泡24 h（料液比約為1︰3 g/mL），將浸泡好的甜蕎粒置于鋪有營養(yǎng)土的育苗盤中，置于溫度為25 ℃、濕度為80%的人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)7 d，再放置于相同溫度、濕度，每天光照12 h的條件下培養(yǎng)2 d，定時噴水，第10天采收；采用FD-2真空冷凍干燥機對甜蕎芽進行干燥，粉碎，過80目篩，冷藏備用[14]。

1.2.2 酚類成分對照品的制備

精密稱取0.007 70 g葒草素對照品、0.001 32 g異葒草素對照品、0.008 98 g牡荊素對照品、0.008 10 g異牡荊素對照品、0.007 20 g蘆丁對照品，分別置于10 mL棕色容量瓶中，加無水甲醇溶解并定容至10 mL，制成標準品儲備液，其質(zhì)量濃度分別為葒草素770 μg/mL、異葒草素132 μg/mL、牡荊素898 μg/mL、異牡荊素810 μg/mL、蘆丁720 μg/mL。分別取適量標準品儲備液置于10 mL棕色容量瓶，加無水甲醇定容至10 mL，制成葒草素38.5 μg/mL、異葒草素26.4 μg/mL、牡荊素44.9 μg/mL、異牡荊素40.5 μg/mL、蘆丁36 μg/mL的混合標準品溶液，于4 ℃保存，備用。

1.2.3 甜蕎芽粉中酚類成分的提取

精密稱取1.000 g甜蕎芽粉樣品于10 mL離心管中，加10 mL 95%甲醇水溶液，搖勻并稱重，于60 ℃超聲處理30 min，取出冷卻至室溫，用95%甲醇水溶液補足質(zhì)量，搖勻，于12 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取過濾液，待測[15]。

1.2.4 甜蕎芽中酚類成分測定的色譜條件

色譜柱ACQUITYUPLC?BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相為甲醇（A）-0.2%冰乙酸水溶液（B）；梯度洗脫為0～3 min，10%～26% A；3～5 min，26%～29% A；5～9.5 min，29%～38% A；9.5～13 min，38%～44% A；13～15 min，44% A；15～17 min，44%～ 10% A；檢測波長為254 nm；柱溫為35 ℃；流速為0.2 mL/min；進樣量為1 μL[15]。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 線性關系考察和檢出限

精密吸取適量“1.2.2”項下混合對照品溶液，置于10 mL容量瓶中，加95%甲醇水溶液定容至刻度，搖勻，配成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按“1.2.4”項下色譜條件測定，每個濃度分別進樣3次，取平均值，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的標準曲線，得到各成分的回歸方程及線性范圍。精密吸取“1.2.2”項下混合對照品溶液，逐級稀釋，以信噪比（S/N）為3時所對應的質(zhì)量濃度作為其檢出限。

1.2.5.2 待測成分的?s/x的計算

以蘆?。╯）為內(nèi)參物，根據(jù)公式?s/x=?s/?x=AxCs/(AsCx)計算蘆丁與葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素之間的?s/x。式中：Cs、Cx分別代表內(nèi)參物與待測物成分的質(zhì)量濃度，As、Ax分別代表內(nèi)參物與待測成分的儀器響應值。再通過?s/x方法計算甜蕎芽中葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素4種成分的質(zhì)量濃度。

1.2.5.3 儀器精密度考察

取適量葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁對照品，按“1.2.2”項下的制備方法制備混合標準品，按“1.2.4”項下色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，記錄葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的峰面積積分值，以峰面積積分值分別計算相對標準偏差（RSD）。

1.2.5.4 方法精密度

取6份甜蕎芽粉末樣品（過80目篩），按“1.2.3”項下樣品溶液的制備方法制備甜蕎芽提取液，按“1.2.4”項下色譜條件測定，記錄葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的峰面積積分值，以峰面積分別計算RSD值。

1.2.5.5 穩(wěn)定性考察

取甜蕎芽粉末樣品，按“1.2.3”項下樣品溶液的制備方法制備甜蕎芽提取液，精密吸取同一樣品溶液，分別在0，4，6，8，12和24 h進樣1 μL，按“1.2.4”項下色譜條件測定，記錄葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的峰面積積分值，按峰面積積分值分別計算RSD值。

1.2.5.6 加樣回收率考察

取已知成分含量寧蕎1號甜蕎芽樣品粉末，精密稱取約1.000 g，共6份，分別加入1 mL葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁對照品，質(zhì)量濃度分別為5.20，2.70，1.93，14.67和2.75 mg/mL，按“1.2.3”項下供試品的制備方法制備提取液，按“1.2.4”項下色譜條件測定。計算葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的平均加樣回收率和RSD值。

1.2.6 樣品測定及一測多評法的驗證

取各個品種的甜蕎芽粉末各約1.00 g，精密稱定，按“1.2.3”方法制備甜蕎芽提取液，采用外標法按“1.2.4”方法測定7種不同品種甜蕎芽中5種成分含量。再按照建立的一測多評法對待測成分進行色譜峰的定位，以蘆丁為內(nèi)標，計算其余待測成分含量。

2 結果與分析

2.1 酚類成分對照品和樣品色譜圖

預試驗對柱溫、波長、流速、流動相等條件進行了考察。結果表明，最佳色譜條件為：ACQUITYUPLC?BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相，甲醇（A）-0.2%冰乙酸水溶液（B）；檢測波長，254 nm；柱溫，35 ℃；流速，0.2 mL/min；進樣量，1 μL。色譜條件經(jīng)過優(yōu)化后，甜蕎芽中葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁5種酚類成分分離良好，出峰時間分別為6.535，6.772，7.438，8.234和8.660 min。

圖1 酚類成分混合對照品溶液色譜圖（A）和樣品色譜圖（B）

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察結果

通過線性回歸分析，得到各成分的回歸方程式和線性范圍，結果見表1。結果表明，葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁分別在77.0～770.0，13.2～132.0，89.8～898.0，81.0～810.0和72.0～720.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

表1 甜蕎芽中5種酚類成分的標準曲線

2.2.2 重復性、穩(wěn)定性、精密度、檢出限與回收率考察結果

葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的精密度、重復性、穩(wěn)定性、相對保留時間、加樣回收率的相對標準偏差均小于2%，由此可知超高效液相儀的精密度良好，甜蕎芽酚類成分重復性良好，酚類成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定；5種酚類成分的回收率在95%～105%之間，說明甜蕎芽酚類成分的提取方法準確可靠；當稱樣量為1.000 g，提取體積為10 mL時，5種酚類成分檢出限范圍為1.00～8.94 mg/kg，結果見表2。

表2 精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、檢出限與回收率考察結果

2.2.3 待測成分的?s/x的計算

由表3可知，各相對校正因子的RSD值分別為2.30%，2.61%，1.50%和3.98%，均小于5%。經(jīng)分析和綜合比較影響相對校正因子的因素，取各質(zhì)量濃度下獲得的相對較正因子（?s/x）的平均值，最終確定葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素與蘆丁的?s/x分別為0.66，2.51，1.30和0.30。

表3 4種酚類成分與蘆丁的相對校正因子

2.3 一測多評法的驗證

分別采用外標法和一測多評法對7種甜蕎芽進行計算，結果見表4。為了確認一測多評法的準確性，用外標法進行比較，葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素的相對誤差范圍分別為1.65%～1.82%，3.52%～ 3.59%，0.87%～1.13%和0.68%～0.72%。ESM實際測定含量與試驗所建立的QAMS計算所得含量，采用DPS軟件對兩種方法測得的數(shù)據(jù)進行分析，經(jīng)配對t檢驗結果顯示，兩種方法所得量值無顯著性差異（p＞0.05），說明試驗所建立的一測多評法具有較好的準確性和可行性，在甜蕎芽的多指標成分質(zhì)量評價中應用是可行的。

同時由圖2可知，品甜2號和紅花甜蕎品種之間的牡荊素和異牡荊素沒有顯著性差異外，其余品種之間各成分均有顯著差異。7種甜蕎芽中5種酚類成分中含量最高的品種都是品甜2號，葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁含量分別為7.55×103，3.70× 103，2.83×103，21.20×103和5.41×103mg/kg；含量最低的是定甜3號，葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁含量分別為2.89×103，1.40×103，1.00×103，7.23×103和1.56×103mg/kg。不同品種之間總酚（5種酚類成分的總和）也有顯著性差異（圖3），含量最高的是品甜2號，為4.08×104mg/kg；含量最低的是定甜3號，為1.41×104mg/kg。

圖2 不同品種甜蕎芽間酚類的比較

圖3 不同甜蕎芽品種間總酚的比較

表4 一測多評法與標準曲線法測定結果 ×103 mg/kg

3 結論與討論

試驗建立了甜蕎芽5種酚類成分的一測多評檢測方法，5種酚類成分的精密度、重復性、穩(wěn)定性、相對保留時間以及加樣回收率的相對標準偏差均小于2%；葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的回收率分別為99.64%，98.68%，101.83%，98.61%和103.75%，在95%～105%范圍之內(nèi)，表明甜蕎芽中5種酚類成分分離良好、各組分色譜峰的峰形對稱、儀器精密度良好，方法學考察表明所建立的甜蕎芽5種酚類成分的超高效液相色譜測定方法準確可靠，可供甜蕎芽中5種酚類成分的快速準確定量。并且利用DPS 14.50軟件對7種甜蕎芽中5種酚類成分的一測多評法計算值和外標法測定值進行差異性分析。結果表明，一測多評法計算值與外標法測定值之間沒有顯著性差異（p＞0.05）。通過分析5種成分之間的差異，異牡荊素是所有甜蕎芽中含量最高的成分，顯著高于其他4種酚類成分（p＜0.05），質(zhì)量濃度范圍為7.16×103～2.10×104mg/kg；牡荊素是所有甜蕎芽中含量最低的酚類成分，顯著低于其他4種酚類成分（p＜ 0.05），質(zhì)量濃度范圍為9.80×102～2.78×103mg/kg；葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁總含量最高的品種是品甜2號，為4.08×104mg/kg，含量最低的品種是定甜3號，為1.41×104mg/kg；由此可見，不同的品種之間各酚類成分的含量具有一定的差異。