一株側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵條件和培養(yǎng)基的優(yōu)化

廖先清 劉芳 周榮華 饒犇 陳偉 王開梅

摘要：為獲得一株側(cè)孢芽孢桿菌（Bacillus laterosporus）（NBF-129）發(fā)酵工藝，以發(fā)酵液活芽孢數(shù)為指標(biāo)，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用正交試驗對其培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果為玉米淀粉2.0%、蠶蛹粉2.5%、酵母浸出粉1.0%、玉米漿1.0%。最佳培養(yǎng)條件為初始 pH 7.5，培養(yǎng)溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速220 r/min。優(yōu)化后的側(cè)孢芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵液芽孢數(shù)達(dá)到4.12×109 CFU/mL，較優(yōu)化前的2.30×109 CFU/mL提高79.1%。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了30 L罐發(fā)酵小試，發(fā)酵周期為35 h，發(fā)酵液芽孢數(shù)為3.96×109 CFU/mL，發(fā)酵液離心濃縮后菌漿冷凍干燥，得到原粉芽孢數(shù)為6.70×1010 CFU/g。

關(guān)鍵詞：側(cè)孢芽孢桿菌（Bacillus laterosporus）;發(fā)酵;培養(yǎng)基優(yōu)化;正交試驗

中圖分類號：Q93;TQ920.6? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）20-0097-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.20.022? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Optimization of culture medium and growth condition of Bacillus laterosporus

LIAO Xian-qing，LIU Fang，ZHOU Rong-hua，RAO Ben，CHEN Wei，WANG Kai-mei

（Hubei Biopesticide Engineering Research Center/Biopesticide Subcenter of Hubei Science

and Technology Innovation Center，Wuhan 430064，China）

Abstract： In order to obtain the fermentation process of a strain of Bacillus laterosporus NBF-129， the culture medium and conditions were optimized by single factor experiment and orthogonal test， using the number of viable spores in the fermentation broth as an index. The optimal fermentation medium were（%）： corn starch 2.0， silkworm pupa meal 2.5， yeast extract 1.0， corn steep liqour 1.0. The optimal fermentation conditions were： initial pH 7.5， culturing temperature 30 ℃， rotation speed 220 r/min. After optimization， the number of viable spores in the fermentation broth reached 4.12×109 CFU/mL， which was 79.1% higher than 2.30×109 CFU/mL before optimization. Under the optimized medium and optimal culturing conditions， a 30-liter tank fermentation test was conducted. The incubation time was 35 hours， The number of viable spores in the fermentation broth reached 3.96×109 CFU/mL. After being concentrated and freeze-dried， the number of raw powder spores was 6.70×1010 CFU/g.

Key words： Bacillus laterosporus; fermentation; culture medium optimization; orthogonal test

側(cè)孢芽孢桿菌（Bacillus laterosporus）是一種好氧型芽孢桿菌，其顯著特點(diǎn)是有獨(dú)木舟狀側(cè)孢，側(cè)孢與芽孢緊密相連，當(dāng)孢囊溶解后側(cè)孢依然牢固地與芽孢結(jié)合在一起[1]。側(cè)孢芽孢桿菌具有殺蟲、抗菌、解磷、解鉀、促生等多種生物學(xué)活性，在功能微生物菌劑開發(fā)等方面具有良好的應(yīng)用前景[2]。因其具有抗逆性強(qiáng)、繁殖所需時間短、營養(yǎng)要求簡單、易于工業(yè)化生產(chǎn)、易定殖等特點(diǎn)，其活菌制劑廣泛用于土傳病蟲害防治、土壤污染修復(fù)、保水抗旱、連作障礙防治、水產(chǎn)養(yǎng)殖等功能性微生物菌劑的研究與開發(fā)。

側(cè)孢芽孢桿菌在實(shí)際生產(chǎn)中存在發(fā)酵產(chǎn)量偏低、工業(yè)化生產(chǎn)不穩(wěn)定等問題，因此本研究以發(fā)酵液中的活芽孢數(shù)為指標(biāo)，采用單因素試驗結(jié)合正交試驗對側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高其發(fā)酵水平，為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)[3]。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 菌株? 側(cè)孢芽孢桿菌NBF-129由湖北省生物農(nóng)藥工程中心發(fā)酵工程研究室從蔬菜根際土壤樣品中分離得到并保存。

1.1.2? 培養(yǎng)基? ①LB培養(yǎng)基。胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，酵母提取物5 g，去離子水1 L，pH 7.0。②基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。玉米淀粉20 g，酵母浸粉7.5 g，蛋白胨15 g，碳酸鈣1.5 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂0.3 g，去離子水1 L，pH 7.0～7.5。

1.2? 方法

1.2.1? 培養(yǎng)方法? ①斜面活化培養(yǎng)。將保存于沙土管的菌種轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至全部形成孢子。②種子液的制備。將斜面菌種活化，接種到液體LB培養(yǎng)基中，在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下培養(yǎng)12～16 h，作為種子液備用。③搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。取1 mL種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵裝液量為50 mL/500 mL，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至芽孢20%左右脫落。

1.2.2? 發(fā)酵條件的優(yōu)化? 分別考察不同培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度以及轉(zhuǎn)速對側(cè)孢芽孢桿菌NBF-129菌株發(fā)酵生長的影響。按基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基配制并接種，振蕩培養(yǎng)至芽孢20%脫落，測定發(fā)酵液的活芽孢數(shù)[4]。

1.2.3? 培養(yǎng)基的優(yōu)化? ①碳源單因素篩選。固定基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源和無機(jī)鹽選取葡萄糖、糖蜜、紅薯粉、玉米淀粉等幾種常見的工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品或副產(chǎn)物作為碳源進(jìn)行篩選，考察不同的碳源對側(cè)孢芽孢桿菌菌株生長的影響。糖蜜用量按干物質(zhì)含量折算。分別按照配方配制培養(yǎng)基并接種，振蕩培養(yǎng)至芽孢20%脫落，測定發(fā)酵液的活芽孢數(shù)。通過單因素試驗確定適宜的碳源。②氮源單因素篩選。固定基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源和無機(jī)鹽，選取蠶蛹粉、菜粕、酵母浸粉、玉米漿、豆粕、魚蛋白胨等6種常見的工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物作為氮源進(jìn)行篩選，考察不同的氮源對側(cè)孢芽孢桿菌菌株生長的影響。玉米漿用量按干物質(zhì)含量折算。分別按照配方配制培養(yǎng)基并接種，振蕩培養(yǎng)至芽孢20%脫落，測定發(fā)酵液的活芽孢數(shù)。通過單因素試驗確定適宜的氮源。③培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取玉米淀粉作為碳源，綜合搭配速效氮源和遲效氮源，選擇蠶蛹粉、酵母浸粉和玉米漿（既能作為氮源又能提供生長因子）作為復(fù)合氮源，無機(jī)鹽固定為碳酸鈣0.1%，硫酸鎂0.03%，磷酸二氫鉀0.1%，進(jìn)行4因素3水平L9（34）的正交試驗（表1），振蕩培養(yǎng)至芽孢20%脫落時下?lián)u床，以發(fā)酵液芽孢數(shù)作為評價指標(biāo)，確定最佳培養(yǎng)基組合。

1.2.4? 30 L罐發(fā)酵小試? 利用發(fā)酵條件優(yōu)化得到的工藝、單因素和正交試驗得出的最佳配方，在30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵試驗，裝液量18 L，消泡劑0.1%，滅菌前pH調(diào)至7.5，滅菌、降溫至32 ℃，接入100 mL種子液，轉(zhuǎn)速控制0～5 h 200 r/min，5～8 h 350 r/min，8 h后500 r/min，通氣量1.2 m3/h，罐壓0.5×105 Pa，培養(yǎng)溫度（31±0.5） ℃，培養(yǎng)至芽孢脫落20%時放罐。發(fā)酵液采用高速離心機(jī)離心，5 000 r/min離心10 min，棄去部分上清液，得到3倍濃縮液，濃縮液冷凍干燥得到凍干粉。

1.2.5? 測定方法? 活芽孢產(chǎn)量測定采用稀釋平板計數(shù)法測定每單位體積或單位重量內(nèi)含有的活芽孢數(shù)，稀釋液置于80 ℃水浴20 min后涂布平板。

1.2.6? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析? 因素顯著性利用Latin軟件進(jìn)行方差分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1? 初始pH? 從圖1可知，當(dāng)初始pH為6.0時，側(cè)孢芽孢桿菌NBF-129培養(yǎng)35 h，芽孢形成率40%左右，芽孢數(shù)較低，菌體有自溶現(xiàn)象;當(dāng)初始pH為7.5時，側(cè)孢芽孢桿菌NBF-129的發(fā)酵芽孢數(shù)達(dá)到最高，為23.8×108 CFU/mL，芽孢形成率達(dá)到95%。初始pH太高或太低均不利于菌體生長和芽孢形成，因此選擇pH 7.5作為側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵初始pH。

2.1.2? 培養(yǎng)溫度? 由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時側(cè)孢芽孢桿菌NBF-129的芽孢數(shù)達(dá)到最高，為24.8×108 CFU/mL;當(dāng)培養(yǎng)溫度為40 ℃時，菌體大部分不能形成芽孢且極不整齊。培養(yǎng)溫度過高影響酶活，芽孢形成受阻。因此選擇30 ℃作為側(cè)孢芽孢桿菌NBF-129培養(yǎng)溫度。

2.1.3? 轉(zhuǎn)速? 如圖3所示，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為180和220 r/min時，側(cè)孢芽孢桿菌NBF-129的芽孢數(shù)均在23×108 CFU/mL左右，表明側(cè)孢芽孢桿菌NBF-129是嚴(yán)格好氧菌。轉(zhuǎn)速在180 r/min時較220 r/min發(fā)酵周期延長1 h，綜合經(jīng)濟(jì)和動力因素，將側(cè)孢芽孢桿菌NBF-129的培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速確定為220 r/min。

2.2? 培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1? 碳源單因素篩選? 從圖4可以看出，不同碳源對側(cè)孢芽孢桿菌NBF-129發(fā)酵的芽孢數(shù)有較大影響，葡萄糖作為碳源時效果最差，芽孢數(shù)僅為5.8×108 CFU/mL，可能是因為葡萄糖是速效碳源，過多的葡萄糖會引起底物阻遏效應(yīng)，使側(cè)孢芽孢桿菌自身的酶系活性下降，影響產(chǎn)物合成水平及芽孢形成。玉米淀粉作為碳源的效果最好，發(fā)酵液芽孢數(shù)為24.5×108 CFU/mL，因此選擇玉米淀粉為側(cè)孢芽孢桿菌NBF-129的碳源。

2.2.2? 氮源單因素篩選? 由圖5可知，側(cè)孢芽孢桿菌NBF-129在含有蠶蛹粉、酵母浸粉、玉米漿、豆粕的培養(yǎng)基中生長良好，活芽孢數(shù)均較高，其中在蠶蛹粉作為單一氮源的培養(yǎng)基中芽孢數(shù)達(dá)35.2×108 CFU/mL。綜合搭配速效氮源和遲效氮源，選擇蠶蛹粉、酵母浸粉和玉米漿（既能作為氮源又能提供生長因子）復(fù)合氮源作為側(cè)孢芽孢桿菌NBF-129培養(yǎng)基的氮源。

2.2.3? 正交試驗結(jié)果? 由表2和表3的結(jié)果分析可知，影響側(cè)孢芽孢桿菌NBF-129發(fā)酵水平主次因素關(guān)系為蠶蛹粉>酵母浸粉>玉米漿>玉米淀粉，蠶蛹粉的F為1.537，對發(fā)酵的影響最大，其次是酵母浸粉和玉米漿，而玉米淀粉對發(fā)酵的影響較小。側(cè)孢芽孢桿菌NBF-129的因素最佳水平為A1B2C3D2，即發(fā)酵最佳培養(yǎng)基為（%）：玉米淀粉2.0，蠶蛹粉2.5，酵母浸粉1.0，玉米漿1.0，碳酸鈣0.1，硫酸鎂0.03，磷酸二氫鉀0.01。

2.3? 30 L罐發(fā)酵小試

利用單因素篩選和正交試驗得到的最佳配方進(jìn)行30 L罐發(fā)酵小試，發(fā)酵周期35 h，發(fā)酵液顯微鏡檢孢子形成率95%左右，孢子20%脫落，大小整齊，發(fā)酵液孢子數(shù)為39.6×108 CFU/mL，3倍濃縮液得到的凍干粉孢子數(shù)為6.70×1010 CFU/g。

3? 討論

從蔬菜根際土壤分離得到側(cè)孢芽孢桿菌，為了獲得其生長的最適培養(yǎng)基及條件，通過單因素試驗及正交試驗對其生長培養(yǎng)基及其條件進(jìn)行優(yōu)化。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝進(jìn)行30 L罐發(fā)酵小試，發(fā)酵周期35 h，發(fā)酵液孢子數(shù)為39.6×108 CFU/mL，3倍濃縮液得到的凍干粉孢子數(shù)為6.70×1010 CFU/g。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基原材料皆為工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，來源廣泛，發(fā)酵工藝簡單，為中試和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)[5]。優(yōu)化的培養(yǎng)基主要氮源蠶蛹粉粗蛋白質(zhì)含量高，且富含蛋氨酸、賴氨酸，與進(jìn)口魚粉大體相當(dāng)，價格僅為魚粉的一半，是很好的蛋白原料。側(cè)孢芽孢桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化中單一速效碳氮源效果都不佳，可能是因為速效碳氮源有利于菌體生長但對代謝產(chǎn)物合成和芽孢形成有一定的阻遏作用，因此原材料的選擇要結(jié)合速效和遲效碳氮源搭配使用。

側(cè)孢芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物具有生物學(xué)功能多樣性，能產(chǎn)生具有較高活性的酶類、激素、細(xì)菌素、多肽抗生素等[6]，而這些物質(zhì)大多是水溶性的。本試驗側(cè)孢芽孢桿菌30 L罐發(fā)酵小試僅采用離心和冷凍干燥后處理方式，活性物質(zhì)的收集有一定損失，后期還要優(yōu)化濃縮和利用干燥工藝，同時提高活芽孢和活性物質(zhì)的收率。

參考文獻(xiàn)：

[1] 邢芳芳，宋? 濤，徐文鳳，等.側(cè)孢芽孢桿菌在生防中的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，46（6）：146-149.

[2] 張念海，易安妮，叢? 莉，等.側(cè)孢芽孢桿菌2002的培養(yǎng)特性及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].生物工程，2011，32（3）：152-156.

[3] 趙云彤.側(cè)孢芽孢桿菌HBL-26發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（5）：112-116.

[4] 葉碧霞，左? 勇，傅? 彬，等.一株枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].生物工程，2017，42（1）：23-28.

[5] 許麗娟，劉冬華，劉? 紅，等.我國微生物農(nóng)藥的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].農(nóng)藥研究與應(yīng)用，2008，12（1）：9-11.

[6] 張? 楹.側(cè)孢芽孢桿菌產(chǎn)生的抑真菌蛋白酶[J].中國生物防治，2006，22（2）：146-149.