桃色頂孢霉獲得及其發(fā)酵液對馬鈴薯瘡痂病菌的抑制作用

馬東梅 李雙 臺蓮梅 劉昕旸 劉振華 孫冬梅

摘要：從土壤中分離得菌株，利用形態(tài)學及18S rDNA測序確定所得菌株為桃色頂孢霉（Acremonium persicinum）。測定該菌株發(fā)酵液不同濃度、不同酸堿度、高溫處理和較長保存時間條件下，對馬鈴薯瘡痂病菌（Streptomyces scabies）的抑菌作用。結果表明，不同濃度的發(fā)酵液對瘡痂病菌均有明顯抑制作用，濃度為75%時抑菌圈半徑最大，為17.1 mm;發(fā)酵液經121 ℃ 20 min處理后，抑菌作用與不處理的相近;室溫保存9個月的發(fā)酵液仍有抑菌效果，但抑菌活性比保存1個月下降了26.43%;發(fā)酵液pH調整為3～8時，抑菌效果良好，且中性、偏堿性比酸性發(fā)酵液抑菌效果好。該菌株發(fā)酵液有較好抑菌效果且穩(wěn)定性良好，有較好的應用前景。

關鍵詞：馬鈴薯瘡痂病菌（Streptomyces scabies）;桃色頂孢霉（Acremonium persicinum）;發(fā)酵液;抑菌效果

中圖分類號：S432.4+2? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）20-0084-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.20.018? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Obtain of Acremonium persicinum and inhibition of its

fermentation on Streptomyces scabies

MA Dong-mei，LI Shuang，TAI Lian-mei，LIU Xin-yang，LIU Zhen-hua，SUN Dong-mei

（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Helongjiang，China）

Abstract： Antagonistic fungi was obtained by soil separation， and the strain was identified as Acremonium persicinum by morphology and 18S rDNA sequencing. The effects of its fermentation on Streptomyces scabies were determined by changing the concentration， pH， temperature and preservation time. Results showed that the inhibition ability of different concentrations were obviously， and the maximum inhibition zone was 17.1 mm of 75% concentration. After the fermentation liquid was treated at 121 ℃ for 20 min， the antibacterial activity was similar to that of the non-treatment. The fermentation liquid kept at room temperature for 9 months still had an antimicrobial effect， but the antibacterial activity decreased by 26.43%， which was lower than one month after preservation. When pH of fermentation liquid was adjusted to 3～8， the inhibition ability was sitll good. Neutral， alkaline fermentation liquid has better antimicrobial effects than acid fermentation liquid. The fermentation liquid of the strain has good antibacterial effect and stability， and has a good application prospect.

Key words： Acremonium persicinum; Streptomyces scabies; fermentation liquid; inhibition ability

馬鈴薯瘡痂病是一種常見的馬鈴薯土傳病害，在日本、韓國、芬蘭、加拿大、美國、中國等馬鈴薯栽培區(qū)均有發(fā)生[1]。馬鈴薯瘡痂病的病原菌是瘡痂鏈霉菌（Streptomyces scabies），該菌主要危害馬鈴薯表皮，致使薯塊表皮產生褐色痂狀硬斑，嚴重時病斑布滿馬鈴薯表面[2]。在中國，馬鈴薯瘡痂病在東北、華北、西南等主要馬鈴薯生產地區(qū)發(fā)生。該病發(fā)生后，對馬鈴薯的外觀和品質影響嚴重，導致其經濟價值降低，造成嚴重的經濟損失，制約馬鈴薯產業(yè)的發(fā)展[3]。該病主要防治手段為化學防治，存在農藥殘留、環(huán)境污染、抗藥性增加等一系列問題[4，5]。鑒于綠色環(huán)保理念，利用拮抗微生物抑制病原菌的增長繁殖不失為一種有效的生物防治手段。

生物防治是利用對植物無害或有益的生物來影響或抑制病原物的生存和活動，從而減少病害的發(fā)生或降低病害的發(fā)展速率[6]。在土壤中尤其是在植物根際存在著大量具有生防潛力的有益微生物，其種類多、數(shù)量大、繁殖快，不僅可以對病原菌進行有效的拮抗抑制而且還有促進植物生長和增產的作用，利用土壤有益微生物防治植物病害具有巨大的應用潛力[7]。土壤中存在的有益微生物種類繁多，在生產上廣泛應用的大體可分為3種，細菌、真菌和放線菌。其中真菌主要有木霉（Trichoderma spp.）、毛殼菌（Chaetomium spp.）、淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）、厚壁孢子輪枝菌（Verticillium chlamydosporium）、小盾殼霉（Coniothyrium minitans）和多種菌根真菌等。

本研究主要探討不同濃度的桃色頂孢霉（Acremonium persicinum）發(fā)酵液的拮抗能力，以及不同pH、溫度條件下發(fā)酵液對抑菌效果及其抑菌穩(wěn)定性的影響，為將其作為生防菌應用于馬鈴薯瘡痂病的生物防治提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試土壤? 土壤采自黑龍江八一農墾大學校園內。

1.1.2? 供試菌? 病原菌馬鈴薯瘡痂鏈霉菌，由黑龍江八一農墾大學生命學院劉權老師贈予。

1.1.3? 培養(yǎng)基? 查氏培養(yǎng)基：NaNO3 2.00 g，K2HPO4 1.00 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，蔗糖30.0 g，瓊脂15.0 g，去離子水1 000 mL，pH自然。

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL，pH自然。

高氏培養(yǎng)基：淀粉20 g，KNO3 1 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，瓊脂 20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，煮沸，121 ℃滅菌25 min。

改良查氏培養(yǎng)基：NaNO3 2 g，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，蔗糖30 g，酵母30 g，去離子水1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌25 min。用于桃色頂孢霉的液體培養(yǎng)。

1.1.4? 儀器? 高性能無菌操作臺（DJ-CJ-ZN型，哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司）;空氣浴振蕩器（HZQ-C型，哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司）;電熱恒溫箱（DRP-9162型，上海森信實驗儀器有限公司）;壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）;光學顯微鏡（XSJ-2型，重慶光學儀器）;pH計（FE28-Standard型，梅特勒托利多集團）。

1.2? 方法

1.2.1? 土壤內真菌的分離與鑒定? 選取校園內山坡上具有代表性的地點，用鐵鍬挖取土壤深度約4～10 cm的土樣，去除較大顆粒，裝入取樣紙袋，將紙袋標記好并帶回實驗室。

稱取5 g陰干的土樣，放入已滅菌的研缽里進行研磨后，用無菌水將土樣稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍的土壤懸液，吸取不同稀釋度的土壤懸液約0.1 mL涂布在PDA培養(yǎng)基上，每組設3個重復，28 ℃恒溫箱暗培養(yǎng)。待菌落長出后，挑取大小、形態(tài)、色澤不同的單菌落在查氏培養(yǎng)基平板上重新培養(yǎng)純化。觀察純化后的菌落形態(tài)以及顯微形態(tài)特征，包括有無分生孢子、形狀以及彎曲度、產孢細胞的著生方式、有無菌核等，鑒定其種類，獲得桃色頂孢霉菌，并將其接入試管斜面保藏。

1.2.2? 桃色頂孢霉發(fā)酵液制備? 將試管斜面保存的桃色頂孢霉菌接種到新鮮的查氏培養(yǎng)基上活化7 d，加無菌水10 mL，用接種環(huán)將桃色頂孢霉的孢子刮下，在裝有200 mL查氏液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中加入孢子懸液10 mL，28 ℃ 130 r/min搖床培養(yǎng)6～12 d，將發(fā)酵液于5 000 r/min離心5 min，上清液經0.22 μm無菌微孔濾膜過濾，獲得拮抗菌株無菌發(fā)酵液。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? 桃色頂孢霉發(fā)酵液拮抗能力測定? 將瘡痂鏈霉菌在高氏一號平斜面上32 ℃培養(yǎng)4～6 d，用無菌水洗下，用移液槍吸取200 μL至高氏一號平板上，用涂布棒涂布均勻。用鑷子將無菌牛津杯放置于上述平板中央，用移液槍吸取200 μL桃色頂孢霉發(fā)酵液加至牛津杯中，于32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察病原菌生長情況，測量抑菌圈半徑。重復3次。

1.2.4? 不同濃度發(fā)酵液抑菌能力測定? 將發(fā)酵液經0.22 μm微孔濾膜過濾后，分裝到5個試管中，加入無菌水調節(jié)發(fā)酵液濃度分別為5%，25%，50%，75%，100%，參照“1.2.3”方法檢測濾液抗菌活性，以無菌水為對照。測量抑菌圈半徑。每個處理重復3次。

1.2.5? 發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性測定

1）熱穩(wěn)定性測定。按“1.2.2”方法制備拮抗菌株無菌發(fā)酵液，在121 ℃條件下高溫滅菌20 min。冷卻后用0.22 μm無菌微孔濾膜進行過濾，參照“1.2.3”方法檢測濾液抗菌活性，以原始無菌發(fā)酵液作為對照。重復3次。

2）酸堿度穩(wěn)定性測定。按照“1.2.2”方法制備拮抗菌株無菌發(fā)酵液，分別取21 mL分裝于7支小試管中，用磷酸緩沖液調節(jié)pH為3～8，然后用0.22 μm無菌微孔濾膜進行過濾，以原始發(fā)酵液作為對照。每個處理重復3次。

3）發(fā)酵液有效保存時間測定。按“1.2.2”方法得到發(fā)酵液，分別保存1、3、6、12個月，參照“1.2.3”方法進行抑菌試驗。

1.2.6? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析? 用DPS和Excel進行數(shù)據(jù)分析

2? 結果與分析

2.1? 真菌的分離與鑒定

從土壤中分離獲得了1株菌落形態(tài)不同于木霉的真菌，該真菌查氏固體平板培養(yǎng)基中的菌落為絨氈狀，菌落表面為淡粉色（圖1）;利用顯微鏡進行形態(tài)學觀察顯示，該菌株的產孢結構為瓶梗，且瓶梗底部膨大，互生，孢子著生在瓶梗頂端（圖2），形態(tài)學初步鑒定為頂孢霉屬。

利用ITS4與ITS5一對通用真菌序列引物，對DNA克隆與擴增，轉化到大腸桿菌DH5α菌株，送測序公司檢測18S rDNA序列。在GenBank中選取與18S rDNA序列相似性大于99%的20株菌株，用Clustalx軟件進行比較，主要集中在頂孢霉屬（Acremonium）;用MEGA4程序中Neighbor Joining方法建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結果表明，該菌與Acremoniumpersicinum FN706545的親緣關系近，結合形態(tài)學結果，鑒定該菌株為桃色頂孢霉（Acremonium persicinum）。

2.2? 不同濃度發(fā)酵液對馬鈴薯瘡痂病菌的抑制效果

牛津杯試驗結果表明，桃色頂孢霉發(fā)酵液對馬鈴薯瘡痂病菌有較強的抑制作用;各處理濃度的桃色頂孢霉發(fā)酵液對馬鈴薯瘡痂病菌有抑菌效果，但抑制效果不同。在一定范圍內，抑菌圈半徑隨著發(fā)酵液濃度的增加而增大，濃度為25%以上時即可很好發(fā)揮抑制作用，當發(fā)酵液濃度為75%時抑菌圈最大，略大于發(fā)酵液濃度為100%時的抑菌圈半徑，而對照組無抑菌作用（圖4）。

2.3? 發(fā)酵液抑菌的穩(wěn)定性

2.3.1? 發(fā)酵液抑菌熱穩(wěn)定性? 在121 ℃滅菌20 min后，頂孢霉發(fā)酵液對瘡痂病菌的抑制作用仍然明顯（圖5），且與不經高溫處理的相比變化不大。這證明了頂孢霉發(fā)酵液中的抑菌活性成分具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.3.2? 發(fā)酵液抑菌酸堿穩(wěn)定性? 利用磷酸緩沖液分別調節(jié)發(fā)酵液pH為3、4、5、6、7、8，抑菌試驗表明，不同酸堿度的發(fā)酵液抑菌效果仍然較明顯。在中性、堿性條件下發(fā)酵液抑菌效果明顯要優(yōu)于酸性條件，在pH為7時，抑菌效果最佳，抑菌圈半徑最大，達到17.1 mm（圖6）。

2.3.3? 發(fā)酵液有效保存時間? 保存時間為1、3、5、7、9個月的發(fā)酵液抑菌試驗表明，抑菌活性在前3個月時無明顯變化，到第5個月時略有下降，直至第9個月時發(fā)酵液的抑菌活性仍然存在，抑菌活性比第一個月下降了26.43%，即該菌株發(fā)酵液抑菌活性可維持時間較長（圖7）。

3? 小結與討論

生物防治在土傳病害防治方面具有獨特的優(yōu)勢，不僅能夠減輕病害發(fā)生， 而且對環(huán)境安全、無污染[8]。篩選生防菌用于馬鈴薯瘡痂病的治療，對于環(huán)保有著較大的意義。徐紅艷等[9]用平板紙片法從刺五加內生放線菌中篩選出對馬鈴薯瘡痂病菌有拮抗作用的16株活性較強且穩(wěn)定的拮抗菌，其中“13-180”菌株的抑菌圈半徑達到了20.165 mm。高同國等[10]鑒定發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌（“12-82”）對馬鈴薯瘡痂病有高效拮抗作用，抑菌圈半徑達13.1 mm。郭鳳柳等[11]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對馬鈴薯瘡痂鏈霉菌同樣有抑制作用，抑菌圈最大半徑達到7.165 mm。林志偉等[12]發(fā)現(xiàn)桃色頂孢霉發(fā)酵液對綠豆白粉病有抑制作用。張雨竹等[13]發(fā)現(xiàn)頂孢霉發(fā)酵液對鐮刀菌的菌絲生長有著明顯的抑制作用，菌絲明顯變稀疏。

本研究結果表明，桃色頂孢霉發(fā)酵液稀釋至75%時，其抑菌圈半徑最大，達17.1 mm。桃色頂孢霉發(fā)酵液不僅具有明顯的抑菌效果，且其熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性較好，121 ℃高溫處理20 min、在pH為3～8條件下，抑菌效果仍然明顯;在發(fā)酵液保存時間長達9個月時，其抑菌效果仍然存在。證明了桃色頂孢霉發(fā)酵液具有較好抑菌作用，同時其穩(wěn)定性良好，具備作為微生物制劑工業(yè)化生產的潛力。

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