穿心蓮內酯對食管癌細胞的放射增敏作用

康亞輝，葛寧，洪福，王娟，周慶，詹必紅

食管癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，病死率占整個惡性腫瘤死亡的第6位［1］，而我國又是食管癌的高發(fā)國家之一，其發(fā)病人數(shù)占全世界50%以上［2］，在全國惡性腫瘤死亡總數(shù)中占了22.34%［3］，病死率為世界最高。食管癌主要類型仍是鱗癌，侵襲性強，預后差。近年來采用術后精確放療配合化療，食管癌5年生存率提高到25%［4］。已有報道穿心蓮內酯（andrographolide）具有抗黑色素瘤（B16F-10）、結腸癌（HT-29）［5］和食管癌（EC9706）［6-7］的作用。本實驗于2017年5月至2018年2月主要研究穿心蓮內酯對ECA-109細胞的增殖抑制作用，遷移和放射敏感性的影響及可能的相關機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑含10%新生牛血清、胰蛋白酶、完全型RPMI 1640培養(yǎng)基均購于美國Gibco公司，穿心蓮內酯購于南京植朗公司（純度＞98%），羊抗兔二抗、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色試劑盒、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、標準蛋白質分子量、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）上樣緩沖液、RIPA蛋白裂解液、TE電泳緩沖液、10×Western轉膜緩沖液、30%（丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺預混液）Acry-Bis、（三羥甲基氨基甲烷）Tris-HCl、過硫酸銨（AP）、SDS、四甲基乙二胺（TEMED）、碘化丙啶（PI）均購于海門碧云天生物技術研究所，B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）及核因子κB（NF-κB）單克隆抗體、驢抗兔-PE藻紅蛋白標記熒光二抗購于美國Santa Cruz公司，（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3）caspase-3多克隆抗體購自谷歌生物，促凋亡蛋白Bax多克隆抗體購自美國Epitomics公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體購自美國BIOWORLD公司，膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/PI雙染色法流式細胞檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，抗磷酸化組蛋白H2AX（γ-H2AX）兔多克隆抗體購于美國Millipore公司，羊抗兔-FITC二抗購于南京海普樂生物科技中心。

1.2 主要儀器倒置顯微鏡（日本Olymbus公司，CKX41-C31BF），酶標儀（美國Bio Rad公司，680），激光共聚焦顯微鏡（德國leica公司，TCS SP5），流式細胞儀（美國BD公司，F(xiàn)ACS Calibur），醫(yī)用直線加速器（美國VARIAN公司，23EX），電泳儀（美國Bio Rad公司，Mini-protean4），紫外分光光度計（南京五義科技有限公司，OD-1000+），凝膠成像儀（美國Bio Rad公司，ChemiDoc XRS+）。

1.3 細胞培養(yǎng)與處理食管癌ECA-109細胞株為安徽省腫瘤醫(yī)院放療科保存，用含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃，含5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.4 照射條件采用6 MV X射線垂直照射，源靶距（SSD）＝100 cm，照射野面積15 cm×20 cm，吸收劑量率為400 cGy/min。

1.5 方法

1.5.1 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測穿心蓮內酯對細胞增殖的影響 指數(shù)生長期細胞，以4～6×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔終體積100 L，待細胞貼壁后，分別加入終濃度為7.5、15、30、60、120、240、360、480 g/mL的穿心蓮內酯，每組設6個復孔，同時設調零組（僅加入RPMI 1640培養(yǎng)基100 L）和空白對照組（僅加入單細胞懸液，即藥物濃度為0 g/mL），分別培養(yǎng)12、24、48 h后，棄去藥物，并加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗1～2遍，每孔加入含5 mg/mL的MTT 20 L，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄去上清，每孔加入150 L二甲基亞砜（DMSO），低速震蕩10 min使紫色結晶充分溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀于波長490 nm處測定各孔吸光度。

1.5.2 細胞劃痕實驗 取指數(shù)生長期ECA-109細胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至細胞完全飽和。分組：空白組，單純放射組，藥物+放射聯(lián)合組，凡用藥組放射前予穿心蓮內酯預處理6 h。一次性與6 MV X線照射，照射后立即更換為無藥完全培養(yǎng)基。采用200 L無菌槍頭在每個皿中劃出等寬的直線劃痕，并用無菌PBS清洗3次。分別于0、6、12、24 h在倒置相差顯微鏡下觀察劃痕的寬度，并拍照記錄（×100）。

1.5.3 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測細胞內半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase3）、Bax、Bcl-2、NF-κB表達 穿心蓮內酯處理細胞6 h后予以放射，繼續(xù)培養(yǎng)2、24 h后收集各組細胞，用1×SDS上樣緩沖液裂解不同處理組細胞，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，制作10%分離膠和5%濃縮膠，待其凝固后加入蛋白樣品15 L。電泳條件：80 V，10 min；120 V，30 min。轉移蛋白至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），轉膜條件：恒流300 Ma，90 min。將轉膜后的PVDF膜浸潤在含5%脫脂奶粉的等滲緩沖鹽溶液（TBST）中1 h，加入特異性一抗（1∶400）于4℃過夜，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫孵育2 h，最后加入發(fā)光底物經X射線曝光顯示蛋白條帶，重復實驗至少3次。其中NF-κB按照碧云天核蛋白提取試劑盒操作步驟提取。

1.5.4 克隆集落形成實驗檢測穿心蓮內酯的放射增敏作用 取指數(shù)生長期的ECA-109細胞，以適當密度接種于6孔板中，待細胞貼壁后分組：空白組、單純穿心蓮內酯的單藥組、單純放射的單放組、穿心蓮內酯+放射的聯(lián)合組，藥物濃度為120 g/mL，照射前藥物預處理6 h，分別給予0、1、2、4、6、8 Gy的6 MV X射線照射，照射后立即更換不含藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液1次，當6孔板中出現(xiàn)肉眼可見克隆時（約10 d），終止培養(yǎng)，棄去上清，用PBS沖洗3遍，無水甲醇固定10 min，姬姆薩染色15 min，然后用流動水洗去染色液，自然晾干后于倒置顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)。按照克隆形成率（%）＝（對照組克隆數(shù)/實驗組細胞數(shù)）×100%，存活分數(shù)（SF）＝實驗組克隆形成率/對照組克隆形成率計算。根據(jù)單擊多靶模型SF＝1-（1-e-D/D0）n，用 GraghPad Prism 5.0 軟件統(tǒng)計擬合細胞存活曲線，式中D為放射劑量，D0為曲線指數(shù)下降63%所需的放射劑量，D0＝1/k，k為存活曲線斜率；Dq＝D0×lnN，Dq為細胞受損所需的準閾劑量。計算放射增敏比（SER）＝對照組D0/實驗組D0，重復實驗3次。

1.5.5 Foci（焦點形成實驗）焦點形成檢測DNA分子損傷 將指數(shù)期ECA-109細胞分組：空白組、單純穿心蓮內酯的單藥組、單純放射的單放組、穿心蓮內酯+放射的聯(lián)合組，藥物濃度為120 g/mL，照射前藥物預處理6 h，給予6 Gy的6 MV X射線照射。以每張載玻片10～20萬細胞甩片制片，制片后加入免疫染色固定液固定，用免疫染色封閉液封閉1.5 h，加入γ-H2AX多克隆抗體（1∶250）4℃過夜，PBS洗滌后加入羊抗兔-PE標記的二抗（1∶150）常溫孵育1.5 h，PBS洗滌后DAPI染核3 min，抗熒光淬滅劑封片后置于濕盒中，在激光共聚焦顯微鏡下檢測foci焦點形成情況（×400）。

1.5.6 免疫熒光實驗檢測Bax表達水平 取指數(shù)生長期細胞進行分組：空白組、單純穿心蓮內酯的單藥組、單純放射的單放組、穿心蓮內酯+放射的聯(lián)合組，藥物濃度為120 g/mL，照射前藥物預處理6 h，給予6 Gy的6 MV X射線照射。以每張載玻片10～20萬細胞甩片制片，制片后加入免疫染色固定液固定，用免疫染色封閉液封閉1.5 h，加入稀釋的Bax單克隆抗體（1∶200）于4℃孵育過夜，用羊抗兔-PE標記的二抗（1∶150）常溫孵育1.5 h，DAPI染核3 min，抗熒光淬滅劑封片后置于濕盒中，在激光共聚焦顯微鏡下檢測Bax的表達（×400）。

1.5.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 將ECA-109的單細胞懸液接種于平皿中，分組：空白組、單純穿心蓮內酯的單藥組、單純放射的單放組、穿心蓮內酯+放射的聯(lián)合組，藥物濃度為120 g/mL，照射前藥物預處理6 h，給予6 Gy的6 MV X射線照射，照射后繼續(xù)孵育24 h收集細胞，用稀釋后的PBS懸浮細胞，使其密度＞1×106/mL。取100 L的細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 L Annexin V-FITC和10 L PI溶液混勻后，于室溫避光孵育15 min。于流式細胞儀上機檢測，激發(fā)波長（Ex）＝488 nm，發(fā)射波長（Em）＝530 nm，計算凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學方法每組實驗重復至少3次，實驗數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，采用GraghPad Prism 5.0擬合細胞存活曲線，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，多組間比較用單因素方差分析，兩組之間采用成組t檢驗比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 穿心蓮內酯對ECA-109細胞增殖的影響用不同濃度的穿心蓮內酯作用到指數(shù)生長期的ECA-109細胞不同時間后觀察細胞的生長情況，可見穿心蓮內酯基本以劑量和時間依賴性抑制食管癌ECA-109細胞的增殖。隨著藥物濃度的升高，對細胞增殖的抑制作用逐漸增強，隨著藥物作用時間的增加，對細胞增殖的抑制作用也逐漸增強。但24 h低劑量藥物組7.5 μg/mL、15 μg/mL出現(xiàn)了毒物興奮效應。穿心蓮內酯處理24 h的ECA-109細胞顯示抑制濃度IC20為95.39 μg/mL，故在后續(xù)研究中使用120 μg/mL（約 IC27）濃度。120 μg/mL 濃度組作用24、48、72 h與相應對照組（0 μg/mL）比較，細胞生長抑制差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1，圖1。

表1 不同濃度的穿心蓮內酯作用不同時間對ECA-109細胞存活率的影響/（%，xˉ±s）

圖1 不同濃度的穿心蓮內酯作用不同時間對ECA-109細胞存活率的影響

2.2 穿心蓮內酯對Eca-109細胞增殖遷移影響空白組隨著時間的推移逐漸“愈合”，而單放組則合攏較為緩慢，聯(lián)合組則沒有合攏的趨勢，說明藥物聯(lián)合放射會影響細胞增殖遷移的能力。細胞經放射后死亡剝脫的細胞明顯增多，聯(lián)合組較單放組更為明顯，說明藥物聯(lián)合放射增加了細胞死亡的程度，增加了放射敏感性。見圖2。

2.3 穿心蓮內酯對凋亡相關蛋白及NF-κB蛋白表達的影響蛋白質印跡法結果顯示，單純藥物對促凋亡蛋白caspase3、Bax的表達可稍上調，說明藥物本身即有促腫瘤細胞凋亡作用，隨時間推移，單純放射也會有明顯的促凋亡蛋白表達增加，而藥物聯(lián)合放射后，這種促凋亡蛋白的表達更加明顯，說明藥物聯(lián)合放射可以明顯增加腫瘤細胞的凋亡。抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達則截然相反，再次驗證的了藥物聯(lián)合放射的增敏效應。核內NF-κB蛋白的表達與Bcl-2趨勢基本一致，說明穿心蓮內酯或許通過NF-κB信號通路發(fā)揮了抗腫瘤作用。見圖3。

注：actin為肌動蛋白，NF-κB為核因子κB，caspase3為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，Bcl-2為B淋巴細胞瘤-2基因，Bax屬于促凋亡蛋白圖3 穿心蓮內酯對凋亡相關蛋白及NF-κB蛋白表達的影響（蛋白質印跡法）：A為空白組；B為單純藥物組；C為單純放射2 h；D為單純放射24 h；E為藥物聯(lián)合放射2 h；F為藥物聯(lián)合放射24 h

2.4 穿心蓮內酯對食管癌細胞放射敏感性的影響食管癌ECA-109細胞經過處理后，根據(jù)單擊多靶模型擬合細胞的存活曲線，計算出加入120 g/mL穿心蓮內酯聯(lián)合放射的SER?？梢娛骨€指數(shù)下降63%的放射劑量下，加入穿心蓮內酯組的細胞存活分數(shù)（0.67±0.04）%明顯低于單純照射組（0.86±0.06）%（t＝4.59，P＝0.02），當細胞受到不同劑量X射線的照射后，加入穿心蓮內酯的處理組，明顯改變了細胞的存活曲線，使存活曲線的斜率增大，D0值下降，SER增加（SER＝1.28），說明穿心蓮內酯具有明顯的放射增敏作用。見圖4，表2。

圖4 穿心蓮內酯對ECA-109細胞放射敏感性的影響

表2 穿心蓮內酯聯(lián)合照射的放射敏感性相關參數(shù)

2.5 Foci焦點形成檢測DNA分子損傷通過檢測γ-H2AX免疫熒光染色后foci焦點形成數(shù)目，觀察細胞核內DNA分子損傷情況（雙鏈DNA斷裂，DSB）。結果一次性予6 Gy照射后，放射后30 min即出現(xiàn)明顯foci焦點，但聯(lián)合組焦點數(shù)更多。2 h后放射組和聯(lián)合組foci焦點數(shù)均少量減少，聯(lián)合組仍明顯多于放射組。24 h后放射組和聯(lián)合組焦點數(shù)明顯減少，聯(lián)合組仍較放射組多。這說明穿心蓮內酯與X射線聯(lián)合作用，有明顯的放射增敏作用。見圖5。

2.6 免疫熒光檢測Bax表達情況通過檢測凋亡相關蛋白Bax反應穿心蓮內酯聯(lián)合放射對食管癌ECA-109細胞影響。結果可見未經處理食管癌ECA-109細胞Bax表達很少。單純使用穿心蓮內酯作用細胞后其表達有所增加，也說明了藥物本身具有促進凋亡作用。單純放射后其表達明顯增加，而聯(lián)合穿心蓮內酯放射后表達尤為顯著。見圖6。

2.7 穿心蓮內酯對ECA-109細胞凋亡的影響采用AnnexinV/PI雙染色后經流式細胞分析儀檢測細胞凋亡情況，結果可見食管癌ECA-109細胞經24 h處理后，聯(lián)合組細胞凋亡率（32.5±0.9）%明顯高于單放組（26.5±2.2）%（P＜0.05）和單藥組（20.8±0.8）%（P＜0.001），聯(lián)合組細胞死亡率（52.5±4.9）%也明顯高于單放組（30.8±0.6）%（P＜0.01）和單藥組（14.1±0.5）%（P＜0.001），說明穿心蓮內酯與X射線聯(lián)合作用，有增加細胞凋亡的作用，即穿心蓮內酯有放射增敏作用。見圖7。

3 討論

近年來中醫(yī)藥逐漸成為抗腫瘤研究的熱門方向，而放療隨著技術的發(fā)展，放療也日益成為治療食管癌的重要手段之一。但傳統(tǒng)的藥物，化療方法和手術治療療效并不理想，容易復發(fā)和遠處轉移。這與腫瘤細胞的自我跟新產生異質性，化療耐藥和放射抗拒密切相關。

穿心蓮為爵床科穿心蓮屬植物，具有清熱解毒、涼血消腫等作用，其主要成分為穿心蓮內酯，為二萜類內酯化合物?，F(xiàn)代藥理研究表明，穿心蓮內酯及其衍生物具有消炎抗菌、抗病毒感染、抗心血管疾病、抗腫瘤、免疫刺激等功能。目前，對穿心蓮內酯的研究主要集中在抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒機制及臨床療效等方面。

本實驗研究結果表明，穿心蓮內酯可以明顯抑制食管癌ECA-109的生長，并與穿心蓮內酯的處理濃度和處理時間成正比，即劑量依賴性和時間依賴性。

細胞凋亡是放療另一個重要作用機制［8］。Caspase家族在介導細胞凋亡中起到重要作用，其中Caspase3是關鍵分子。Bcl-2是與凋亡密切的原癌基因之一，Bcl-2家族包括Bcl-2、Bax、Bad、Bcl-x等。以上凋亡相關蛋白不僅和惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關，還參與放射誘導細胞凋亡［9］。本研究結果顯示，穿心蓮內酯可以上調促凋亡蛋白Bax和細胞凋亡效應性蛋白裂解酶Caspase3，下調抑制凋亡蛋白Bcl-2。聯(lián)合放射后更加明顯。由此推斷，穿心蓮內酯可能是通過調節(jié)這些凋亡相關蛋白進而誘導細胞凋亡的發(fā)生，并且聯(lián)合放射后這種調節(jié)作用更加明顯。

活化的NF-κB可以進入核內與下游調控基因上Kb序列結合，參與細胞的增殖、轉化、侵潤和抗凋亡。然而，抑制NF-κB信號通路的活性會阻斷它促進下游基因表達的功能。抑制NF-κB的活化可以抑制腫瘤細胞的增殖，會引起細胞周期的停滯并誘導凋亡［10-11］。本研究結果顯示，穿心蓮內酯可以下調食管癌細胞ECA-109中細胞核內NF-κB的表達，聯(lián)合放射后下調作用更加明顯，其總體趨勢與Bcl-2基本相一致。由此推斷，NF-κB在調節(jié)細胞凋亡上起到和Bcl-2類似的抗凋亡作用，聯(lián)合放射后該作用更加明顯，這提示了穿心蓮內酯對ECA-109細胞的作用機制可能與抑制NF-κB信號通路密切相關。

此外，本研究將無明顯不良反應的低濃度穿心蓮內酯預處理后，可明顯增加食管癌細胞ECA-109對X射線的敏感性，其SER為1.28。這可能與凋亡相關蛋白調節(jié)機制相關。

雖然其作用機制還有待進一步研究，但本研究結果表明穿心蓮內酯不僅僅可作為抗食管癌細胞生長和轉移的有效抗腫瘤藥物，也可作為一種食管癌放射增敏的新藥。

（本文圖2，5～7見插圖12-4）

圖2 穿心蓮內酯對ECA-109細胞增殖遷移影響（×100）：A為空白組，B為單放組，C為聯(lián)合組

圖5 Foci焦點形成檢測DNA分子損傷（免疫熒光＋DAPI染色×400）：A為空白組，B為放射30 min組，C為聯(lián)合30 min組，D為放射2 h組，E為聯(lián)合2 h組，F(xiàn)為放射24 h組，G為聯(lián)合24 h組

圖6 免疫熒光檢測Bax表達情況（免疫熒光＋DAPI染色×400）：A為空白組，B為單藥組，C為單放組，D為聯(lián)合組

圖7 不同措施處理后的ECA-109細胞凋亡情況：A為空白組，B為單藥組，C為單放組，D為聯(lián)合組