茶樹油提取工藝優(yōu)化和體外抑菌活性研究

程 峰，牛 彪，梁 妍，梁劍平，劉 宇

(中國農業(yè)科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，農業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點試驗室，甘肅省新獸藥工程重點試驗室，甘肅 蘭州 730050)

0 前言

茶樹油(Tea Tree Oil,TTO) 也稱互葉白千層油，從桃金娘科互葉白千層樹的葉和嫩枝中利用水蒸氣蒸餾法提取得到，是一種無色至淡黃色油狀液體，具有怡人的芳香氣味.白千層萜品型香料油，具有良好的殺菌抑菌及保健作用.互葉白千層樹原產(chǎn)于澳大利亞的新南威爾士州和新西蘭的部分地區(qū)[1].中國自20世紀90年代開始，由廣東、廣西、海南、福建、云南等地開始引種，并形成一定的種植規(guī)模.茶樹精油具有良好的廣譜殺菌抑菌及保健作用，可抗病毒[2]、抗菌[3-4]、激活免疫因子[5]、抗寄生蟲[6]、抗氧化防腐促進傷口愈合[7]，是一種可替代抗生素的優(yōu)良天然抗菌劑，無毒無公害[8],已被廣泛應用于基礎醫(yī)藥衛(wèi)生、日用化工、香料、食品、制藥等行業(yè).茶樹油按照主要成分含量的不同，分為4-松油醇型 (4-松油醇≥ 30%)、1,8-桉葉素型 (1,8-桉葉素≥ 35%) 和異松油烯型(異松油烯≥ 40%) 3種類型.1996年，國際標準化組織頒布茶樹油標準[9]之后，我國于2011年5月12日發(fā)布互葉白千層(精)油，松油烯-4-醇型[茶樹(精)油]的國家標準，規(guī)定了特征組分含量，其中1,8-桉葉素≤5%，松油烯-4-醇 ≥30%，于2011年11月1日正式試施.對于這種已規(guī)定國家標準的天然藥物，為了使得到的茶樹油生產(chǎn)工藝合理且特征組分相對穩(wěn)定，主要從影響揮發(fā)油提取的3個關鍵因素出發(fā)，即料液比、浸泡時間、提取時間來對茶樹油的提取工藝進行研究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

揮發(fā)油提取器、2 000 mL圓底燒瓶、蛇形冷凝管(天津恒山化工科技有限公司)；調溫電熱套(北京科偉永興儀器有限公司)；沃特浦超純水機(四川沃特爾水處理設備有限公司)；電熱恒溫生化培養(yǎng)箱(上海鴻都電子科技有限公司)；立式壓力蒸氣滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠公司)；生物安全柜(上海力申科學儀器有限公司)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(天津歐諾儀器股份有限公司)；DMSO(萊陽化工試驗廠)；牛津杯(d=6 mm)、培養(yǎng)皿、涂布棒、移液槍、鑷子、試管等.

1.1.2 菌株

大腸埃希菌(Escherichiacoli，CICC10389) 、白色念珠菌(Candidaalbicans，CICC1965) 、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus，CICC10384) 、白色葡萄球菌(Staphyloccocusalbus，CICC10897 ) 及綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa，CICC10419) ，均由中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所農業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點試驗室和甘肅省新獸藥工程重點試驗室提供.

1.1.3 主要試劑

改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基(海博生物科技有限公司)；營養(yǎng)肉湯，MHA培養(yǎng)基、MHB培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術有限責任公司)；無水硫酸鎂(天津市凱信化學工業(yè)有限公司)；無菌生理鹽水(索萊寶生物有限公司)；自制濾紙片(d=6 mm)21 ℃高壓后待用，試驗中用到的其他試劑均為分析純.

1.1.4 樣品

茶樹枝葉，2017年 11 月份購自廣東省橫縣地區(qū)，由蘭州大學藥學院馬志剛教授鑒定，植物標本(20171120)存于中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所農業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點試驗室.

1.2 方法

1.2.1 茶樹油的提取

將從廣西橫縣購買來的茶樹枝葉用剪刀剪成長約40～60 mm，在室溫條件下將其表面的水分自然蒸干至恒重.運用《中國藥典》附錄XD中揮發(fā)油測定法甲法[10]中的相關內容進行水蒸氣蒸餾，向得到的茶樹油中加入無水硫酸鎂，以除去全部的水分，并用電子天平稱重并計算供試品中揮發(fā)油的含量(%).

1.2.2 單因素考察

根據(jù)資料顯示，茶樹油的提取得率與料液比、浸泡時間與蒸餾時間相關，因此，首先通過單因素試驗考察茶樹葉和嫩枝中茶樹油的提取工藝.

1.2.2.1 浸泡時間的考察

準確稱取42.4 g/份(恒重30 g/份)茶樹葉和嫩枝，共6份，按照1∶18的料液比向圓底燒瓶中加入超純水，通過浸泡不同的時間后，提取4 h，記錄提取量(g)來考察浸泡時間對茶樹油提取得率的影響.

1.2.2.2 料液比的考察

準確稱取42.4 g/份(恒重30 g/份)茶樹葉和嫩枝，共18份，在最佳浸泡時間6 h條件下，按照1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25及1∶30料液比，提取4 h來考察料液比對茶樹油得率的影響，每個水平做3次重復，記錄不同料液比的提取得率，并計算累計提取得率(%).累計提取得率(%)=平均提取量/飽和提取量*100%.

1.2.2.3 提取時間的考察

準確稱取茶樹葉和嫩枝42.4 g/份(恒重30 g/份)，共18份，在最佳浸泡時間6 h，料液比1∶20的最佳條件下，考察提取時間分別為1 h、2 h、4 h、6 h、8 h和10 h對茶樹油提取量的影響，每次試驗做3次重復，記錄不同的茶樹油提取量及累計提取得率(%).

1.2.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，結合實際生產(chǎn)及提取得率，選擇對揮發(fā)油影響較大的浸泡時間、提取時間及料液比為正交因素，設定3個水平，建立L9(34)正交試驗表安排試驗，以揮發(fā)油的提取量(g)為考察指標.

1.2.4 體外抑菌試驗1.2.4.1 菌懸液的制備

將試驗室4 ℃斜面保存的大腸埃希菌(Escherichiacoli，CICC10389)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus，CICC10384) 、白色葡萄球菌(Staphyloccocusalbus，CICC10897 ) 及綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa，CICC10419) ，白色念珠菌(Candidaalbicans，CICC1965)前4種劃線接種于MHA瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，最后1種接種于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h.分別挑去單菌落，接種于營養(yǎng)肉湯中，前4種在37 ℃培養(yǎng)24 h，白色念珠菌28 ℃培養(yǎng)48 h，用無菌生理鹽水稀釋菌液濃度為1×106～5×106CFU/mL[11]，待用.

1.2.4.2 抑菌圈的測定[12]

先將TTO用吐溫-80、無水乙醇及超純水配制成8%的乳濁液，采用管蝶法(Wang Y et al.,2009)，牛津杯(d=6 mm)，經(jīng)121 ℃高壓滅菌后待用.取菌懸液150 μL，涂于平板后，用已滅菌鑷子夾取3只牛津杯等間距放于平板中.然后在試驗組牛津杯中加入150 μL 8% TTO乳濁液，陽性對照組加入150 mL 50% 84消毒液，陰性對照組加入150 μL除去TTO的乳濁液，緩慢蓋住平皿，C.albicans,CICC1965 28 ℃培養(yǎng)48 h，其余細菌放在37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h.每組試驗進行3次后測定其抑菌圈直徑.

1.2.4.3 MIC及MBC的測定[13-14]

由于TTO與培養(yǎng)液不相溶，采用DMSO為助溶劑，經(jīng)預實驗知：DMSO/TTO=1∶19時DMSO對待測試菌的生長無影響，將其稱為精油乳劑.按上述比例各先配制TTO乳劑5 mL(濃度843.6 mg/mL)，然后采用肉湯稀釋法及點種法來測定MIC及MBC，即將已高壓的80支試管平均排成8排于超凈臺，從左至右依次編號為1、2、…、10號，向前7排每支試管中加入1 mL MH(B)液體培養(yǎng)基，第8排每支試管中加入1 mL改良馬丁培養(yǎng)基，依次吸取1 mL TTO乳劑于前7排1號管中.連續(xù)振蕩搖勻后吸取1 mL至每排中第2號、第3、4、5、6、7號試管制成不同濃度的TTO乳劑，再吸取3.8 mL相對應的液體培養(yǎng)基于上述試管中.每一排對應一個菌種并依次標注.然后取200 μL菌懸液于相應的試管中，則每株菌試管中含有的TTO濃度依次為84.36 mg/mL、42.18 mg/mL、21.09 mg/mL、10.55 mg/mL、5.27 mg/mL、2.64 mg/mL、1.32 mg/mL，第8號未加入TTO作同組陽性對照，9、10號未加入菌懸液做液體培養(yǎng)基及空白對照.試驗重復3次，將前7排試驗完的試管放入37 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中緩慢振蕩培養(yǎng)24 h，第8排試管置入28 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中緩慢搖至48 h.到相應時間后從各試管中取200 μL于已倒好的相應培養(yǎng)基中，用涂布棒涂勻后再培養(yǎng)相應的時間后計數(shù)菌落個數(shù)，平皿中菌落數(shù)≤5對應的TTO濃度為該菌的MIC.將各試管繼續(xù)在相應的溫度下振蕩培養(yǎng)24 h后，按上述方法接種后未出現(xiàn)菌落生長的最小精油濃度為該菌的MBC.

圖1 浸泡時間對茶樹油提取得率的影響

2 結果與分析

2.1 單因素試驗考察結果

2.1.1 浸泡時間對茶樹油提取得率的影響

由圖1可以看出，茶樹油的提取量隨著浸泡時間的延長而增大，在8 h時達到最大.當?shù)竭_10 h時，提取量基本保持不變，這可能與茶樹葉和嫩枝中的細胞全部處于溶脹有關.另外,在浸泡時間為6 h時，提取量已與最大值相接近，得率為2.15%.在實際工業(yè)生產(chǎn)中本著節(jié)約時間及能源的原則，可認為茶樹葉和嫩枝在6 h時已完全浸透，6 h可作為最佳浸泡時間.

2.1.2 不同料液比對茶樹油提取得率的影響

圖2不同料液比對茶樹油提取得率的影響 圖3不同提取時間對茶樹油提取得率的影響

由圖2可以看出，在料液比為1∶25時，累計提取得率趨于穩(wěn)定，在料液比為1∶30時，基本不再增加，因此可認為1∶25為最佳料液比，有利于茶樹油的提取.

2.1.3 不同提取時間對茶樹油提取得率的影響

圖3反應出,茶樹油的提取量隨著時間的增加逐漸增大，在提取時間為8 h時達到最大，而且在10 h時有微弱減小的趨勢.這可能與長時間加熱致提取裝置的熱傳遞，揮發(fā)油提取器溫度過高使少部分茶樹油隨水分的蒸發(fā)造成損失.

2.2 正交試驗考察

2.2.1 正交試驗安排

結合單因素試驗，以茶樹油提取得率為考察點進行正交試驗安排，結果見表1.

表1正交試驗因素水平

2.2.2 正交試驗結果及方差分析

按照表1的相關內容，考察各水平及各因素試驗條件，建立如下正交試驗及相關結果，以茶樹油提取量為考察指標，見表2、3.

表2正交試驗及相關結果

表3 正交試驗方差分析表

從正交試驗及相關結果表并結合實際生產(chǎn)，得出正交因素的影響順序為：B>C>A，提取條件以A3B2C2為最佳，即提取時間6 h，浸泡時間8 h，料液比1∶20.但從正交方差分析結果可以看出，A因素下三水平未反應出顯著性，結合單因素結果，在浸泡6 h及8 h時，得到的TTO的量基本一致.但在2 h、4 h時卻和最佳時間相比對應的量相差很大，2 h尤為突出，從而再次確認了6 h為最佳浸泡時間.同理，料液比1∶20及1∶25條件下對應的量相差不太明顯.在節(jié)約成本及原料的前提下，選擇料液比為1∶20.因此，TTO提取的優(yōu)化工藝為：在料液比1∶20的條件下，浸泡6 h，提取6 h.

2.2.3 正交試驗的工藝驗證

取和上述試驗相同的茶樹枝葉42.4 g/份(恒重30 g/份)，共3份.按照所選的工藝優(yōu)化條件進行提取，計算茶樹油提取得率,結果見表4.可以看出,在料液比1∶20的條件下，浸泡6 h，提取6 h的提取條件下，茶樹油平均提取率可達到2.293%，RSD值為1.549%.

表4提取工藝驗證表

2.3 體外抑菌活性的研究結果

2.3.1 抑菌圈考察結果

利用濾紙片法研究了提取的茶樹油對5種病原菌的抑菌活性，結果表明：茶樹油對白色念珠菌、大腸埃希菌的抑菌活性稍低外，對其余3種常見病原菌都具有良好的抑菌活性，其中對金黃色葡萄球菌抑菌作用最強，其次為白色葡萄球菌、綠膿桿菌，具體結果見表5.

2.3.2 茶樹油對常見病原菌MIC和MBC的測定結果

茶樹油對常見病原菌MIC和MBC的影響，結果見表6.可以看出：茶樹油對大腸埃希菌的MIC值最小，為2.64～5.27 mg/mL；對白色葡萄球菌的MIC最大，為21.09～41.18 mg/mL；對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌及白色念珠菌MIC相等，為5.27～10.55 mg/mL.茶樹油對白色葡萄球菌的MBC值最大，為21.09～41.18 mg/mL，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、綠膿桿菌的MBC值相等，為10.55～21.09 mg/mL.

表6茶樹油對常見病原菌的MIC和MBC

3 討論與結論

本試驗所用的互葉白千層枝葉在購買后進行人工裁剪，所形成的長度大致40～60 mm，過短會使枝葉中部分油在裁剪的過程中隨水分散失，影響提取得率；過長在圓底燒瓶不好被水浸沒及取出，影響出油率及提取效率.因此，對剪枝長短未進行考察.

由于互葉白千層枝葉中水分相對較高，導致其本身的質量比重較大.在提取試驗前，只靠裁剪后通過暴露在室溫中表面的水分除去，其本身細胞內部的水分未在恒溫箱中除去，而在計算過程中按恒重計算，導致提取得率偏高.未進行全面干燥主要是因為茶樹葉和嫩枝中的一部分油在高溫下進行揮發(fā)，影響提取得率.這和一般的提取試驗有差異.至于高溫提取率多少、影響大小還需進一步試驗研究.

由于水蒸氣蒸餾得到的茶樹油一部分溶解在水中，賈媛等[15]在優(yōu)化香茅精油的提取工藝時發(fā)現(xiàn)，加入適量的(約10%)NaCl可以降低精油在水中的溶解度，從而能提高提取得率.對于不同的植物精油是否有同樣的效果，還需研究人員再次實驗驗證.

通過單因素試驗、正交試驗及相關工藝驗證，科學合理地優(yōu)化了茶樹葉和嫩枝的提取工藝，揭示了茶樹油提取中主要影響因素為提取時間和料液比，其次為浸泡時間.茶樹油提取的最佳工藝為：料液比1∶20，浸泡6 h，提取6 h.

本文利用管碟法和試管系列稀釋法研究了茶樹油對常見5種病原菌的抑菌活性，結果表明，茶樹油對白色葡萄球菌的抑菌活性相對較低外，對其余4種菌有較高的抑菌活性.茶樹油對5種常見菌的MIC為2.64～41.18 mg/mL，MBC為10.55～41.18 mg/mL，且呈現(xiàn)出濃度依賴性.

隨著抗生素耐藥性的加劇，植物源抗菌藥物大力被開發(fā)，而尋找最優(yōu)的提取工藝是研究工作者的重要部分，能將其應用于臨床治療及食品生產(chǎn)，具有跨時代的意義.本文希望能為植物精油的研究與開發(fā)提供理論支撐.