慢性心力衰竭大鼠腦血流量變化及其一氧化氮合酶作用機(jī)制

陸梓雯，趙明鏡，王 蕾，楊 濤，趙一舟，仇 琪，成文堃，李 彤，王保福，楊京京，李 洋，蔣洋洋

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)作為最常見的心血管疾病之一，是各種心臟疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)或晚期階段，全世界至少2 600萬人的健康受到影響[1]。在我國35～74歲人群中，心力衰竭的患病率為0.9%，病人住院病死率為4.1%，其死亡率仍遠(yuǎn)高于其他疾病，成為社會重大的公共衛(wèi)生問題[2]。相關(guān)研究表明，25%～85%的慢性心力衰竭病人?；加胁煌潭鹊恼J(rèn)知功能障礙，如記憶能力、學(xué)習(xí)能力和注意力下降，執(zhí)行功能差等[3-4]。心力衰竭和認(rèn)知功能障礙疊加會增加病人的住院率和死亡率，心力衰竭伴有認(rèn)知障礙的病人中因病情惡化而重復(fù)住院的概率比心力衰竭不伴認(rèn)知障礙的病人高26%[5]。然而關(guān)于心力衰竭后認(rèn)知功能障礙的病理生理機(jī)制尚不清楚。一些臨床研究認(rèn)為，心力衰竭后病人腦血流量下降可能與認(rèn)知功能障礙有關(guān)[6]，然而也有研究顯示心力衰竭后腦血流量并沒有變化[7]，因此對于心力衰竭后腦血流的變化仍不確定。同時考慮到臨床結(jié)果受到多種疾病和危險(xiǎn)因素的干擾，因此采用疾病單純的動物模型，觀察心力衰竭后腦血流的變化和研究相關(guān)機(jī)制非常必要。中醫(yī)理論認(rèn)為“心主神明”，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也認(rèn)為心的功能會影響腦的生理功能[8]。本研究通過建立大鼠心肌梗死后心力衰竭模型，探討心力衰竭后腦血流量的變化及其相關(guān)的機(jī)制，為中醫(yī)“心主神明”理論提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及飼養(yǎng) 雄性SD大鼠30只，體重230～240 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證編號SCXK(京)2019-0009，分籠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障級動物房[室溫(24±1)℃，濕度(60±10)%]。每天提供給大鼠標(biāo)準(zhǔn)的飼料與飲用水。

1.2 儀器 小動物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)；心電圖機(jī)(上海醫(yī)學(xué)電子儀器廠)；超高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics公司，探頭型號MS-201)；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(上海欣軟科技有限公司)；激光散斑多普勒血流儀(瑞典PERIMED公司)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 試劑 內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抗體(美國Abcam公司，貨號：ab5589)；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗體(美國Abcam公司，貨號：ab3523)；羊抗兔IgG多克隆抗體(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號 C1309-100)。

1.4 動物心肌梗死后心力衰竭造模[9]將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組。動物稱重后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進(jìn)行麻醉，胸部皮膚備皮，固定于鼠板上。經(jīng)口腔行氣管插管術(shù)，連接呼吸機(jī)，觀察動物呼吸情況。沿大鼠胸骨左側(cè)3～4肋間切開皮膚，打開胸腔。輕輕提起心耳，在肺動脈圓錐與心耳之間，心耳邊緣下2～3 mm，結(jié)扎左冠狀動脈前降支。關(guān)閉胸腔依次分層縫合肋骨、肌肉和皮膚，移除呼吸機(jī)，觀察動物呼吸情況。動物術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素，每天4×105U。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。動物手術(shù)死亡率約為20%，每組12只大鼠。

1.5 超聲檢測和心電圖檢測 動物經(jīng)1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，行十二導(dǎo)聯(lián)心電圖檢測。心電圖檢測分別在術(shù)前、術(shù)后即刻和術(shù)后第60天進(jìn)行。超聲心動檢測于術(shù)后第60天進(jìn)行，使用15 MHz高頻探頭，取左室乳頭肌短軸切面及左室長軸切面，二維超聲引導(dǎo)下，測定射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)和短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)。

1.6 Morris水迷宮行為學(xué)檢測 應(yīng)用Morris水迷宮評價(jià)動物認(rèn)知功能[10]。水迷宮圓形水池直徑160 cm，水深27 cm，水溫(24±1)℃，池內(nèi)有一直徑為12 cm的圓形平臺，低于水面1.5 cm，作為大鼠逃生的平臺。房間四周有五角星、三角形等形狀作為提示線索。水迷宮分為S、N、W、E 4個入水點(diǎn)。

1.6.1 定向航行實(shí)驗(yàn) 平臺位于SW象限，首先將大鼠置于平臺上5 s中，使其熟悉周圍環(huán)境，然后將大鼠從其余3個入水點(diǎn)隨機(jī)面壁放入水池中，其尋找平臺時間限定為120 s，如果大鼠沒有在120 s內(nèi)找到平臺，則實(shí)驗(yàn)者將大鼠放置于平臺上5 s以加強(qiáng)記憶。每天3次，連續(xù)3 d。記錄大鼠平均潛伏期與路程，沒有找到平臺大鼠的潛伏期按120 s記錄。

1.6.2 穿臺實(shí)驗(yàn) 在定向航行實(shí)驗(yàn)24 h后，撤去平臺，將大鼠面壁放入水池中，限定時間為120 s。記錄其穿越平臺位置的次數(shù)。認(rèn)知評價(jià)后，每組8只動物做腦血流檢測，另外每組4只動物進(jìn)行其他檢測。

1.7 腦血流檢測 動物經(jīng)1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后20 min，俯臥，固定頭部，剔除頭頂部皮毛，剪開皮膚，使用鈍刀片去除顱骨周圍軟組織，使其暴露出顱骨。根據(jù)腦定位圖譜，前囟右側(cè)旁開5 mm、下3 mm定位右側(cè)頂葉感興趣區(qū)。使用牙科鉆制作骨窗，將顱骨打磨薄，可隱約看到大腦皮質(zhì)。腦血流儀監(jiān)測感興趣區(qū)血流量，監(jiān)測距離18.9 cm，監(jiān)測時間5 min。腦血流檢測后處死動物取材。

1.8 Western Blot法檢測 提取腦組織蛋白，每組4只，測定濃度。將提取樣品緩慢加入凝膠上樣孔中，使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，設(shè)定電壓200 V電轉(zhuǎn)2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗，4 ℃過夜。TBST洗膜，孵育二抗1 h，洗膜，發(fā)光。使用Image J軟件分析灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠心電圖結(jié)果比較 模型組大鼠術(shù)后第60天心電圖Ⅰ、aVL、V1～V6出現(xiàn)明顯的病理性Q波(見圖1B2)，說明心力衰竭大鼠有透壁性心肌梗死。術(shù)后第60天取材可見，心力衰竭大鼠的左心室前壁心肌組織被纖維結(jié)締組織取代，形成室壁瘤。詳見圖1B1。而假手術(shù)組的心電圖和心臟均正常(見圖1A1、圖1A2)。

A1、A2為假手術(shù)組；B1、B2為模型組

2.2 兩組大鼠心臟超聲結(jié)果比較 假手術(shù)組大鼠心室收縮運(yùn)動呈現(xiàn)M型波，而心力衰竭大鼠的前壁波形變平、變直，甚至消失，說明心力衰竭大鼠心室運(yùn)動減弱。模型組EF值和FS值較假手術(shù)組明顯下降(P<0.05)。詳見表1、圖2。

%

與假手術(shù)組相比，1)P<0.05

假手術(shù)組 模型組

2.3 心力衰竭大鼠腦認(rèn)知功能評價(jià)結(jié)果

2.3.1 兩組大鼠定向航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 模型組和假手術(shù)組大鼠在第1天、第2天、第3天的定向航行實(shí)驗(yàn)中，平均潛伏期、總路程、游泳速度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2～表4。

表2 兩組大鼠平均潛伏期比較(±s) s

表3 兩組大鼠平均總路程比較(±s) cm

表4 兩組大鼠游泳速度比較(±s) cm/s

2.3.2 兩組大鼠穿臺次數(shù)比較 在穿臺實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠穿越平臺的次數(shù)明顯低于假手術(shù)組(P<0.01)，說明心力衰竭大鼠的空間記憶能力明顯受損。

表5 兩組大鼠穿越平臺次數(shù)比較(±s) 次

與假手術(shù)組相比，1)P<0.01

2.4 兩組大鼠腦血流灌注量比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦部血流灌注量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表6和圖3。

表6 兩組腦部血流灌注量比較(±s) PU

假手術(shù)組 模型組白色圓圈所示為感興趣區(qū)數(shù)值測量范圍

2.5 兩組大鼠腦組織中eNOS和iNOS表達(dá)含量 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠大腦皮質(zhì)中eNOS的相對表達(dá)量有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而iNOS的相對表達(dá)量無明顯變化。詳見圖4。將大鼠腦組織中eNOS與iNOS的相對表達(dá)量作比值，發(fā)現(xiàn)心力衰竭大鼠eNOS/iNOS比值的相對表達(dá)量明顯低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖5。

S：假手術(shù)組；M：模型組圖4 兩組腦組織eNOS和iNOS表達(dá)量比較

與假手術(shù)組相比，*P<0.05圖5 兩組eNOS/iNOS比值的相對表達(dá)量比較

3 討 論

臨床上慢性心力衰竭病人常伴有不同程度的認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重影響病人的生存質(zhì)量并增加重復(fù)住院率及死亡率。關(guān)于心力衰竭后所引起認(rèn)知功能障礙的病理機(jī)制尚不明確。一些研究認(rèn)為腦部血流量的降低可能是影響心力衰竭后認(rèn)知功能障礙的主要原因，然而另一些研究結(jié)果相互矛盾[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管eNOS與iNOS比值明顯降低，但慢性心力衰竭大鼠腦血流量并未發(fā)生明顯的變化。

本研究采用左側(cè)冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù)造成心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，結(jié)果可見，模型組大鼠心電圖出現(xiàn)病理性Q波，且心臟超聲EF和FS值明顯降低，說明模型組大鼠心功能明顯降低，符合心力衰竭的診斷。在認(rèn)知功能評價(jià)中，心力衰竭大鼠的穿越平臺的次數(shù)明顯降低，表明心力衰竭大鼠存在明顯的記憶功能障礙，這也與臨床心力衰竭病人的情況相似。

有效腦血流量是正常腦功能的前期，關(guān)于心力衰竭后腦血流的變化還存在很多的爭議。Roy等[12]研究表明，心力衰竭病人腦血流量往往是明顯減少的[13]，主要集中在額葉、頂葉、顳區(qū)、小腦等腦區(qū)。研究認(rèn)為造成心力衰竭后腦血流量降低的首要原因是心排出量降低導(dǎo)致心肌缺血缺氧改變了腦組織以及血管的結(jié)構(gòu)；其次由于受到神經(jīng)體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)和腎素-血管緊張素系統(tǒng)的影響，大腦的自主調(diào)節(jié)能力降低[14]。此外，臨床心力衰竭病人常伴有高血壓、血脂異常等疾病，其內(nèi)皮功能常受損和血管代償能力差，也可能造成腦血流降低。然而，另一些學(xué)者的研究又出現(xiàn)了不同甚至相反的結(jié)果。Erkelens等[7]認(rèn)為心力衰竭病人全腦的血流灌注量并沒有發(fā)生變化，認(rèn)為其是毛細(xì)血管前動靜脈吻合來應(yīng)對靜脈壓力升高的代償機(jī)制保證腦區(qū)的血流并沒有發(fā)生變化。Mansur等[11]研究表明，心力衰竭后腦血流量變化是增加的，這種增加的主要原因可能是因?yàn)樾牧λソ呒毙云谝饳C(jī)體產(chǎn)生多種代償機(jī)制，如血壓升高、心率加快、血漿去甲腎上腺素水平升高，進(jìn)而引起了局部血流量的增加。由此可見，腦血流這些矛盾的結(jié)果可能與研究對象的合并癥、疾病的程度及疾病的不同階段有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠的腦血流灌注量變化不明顯。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的可能原因：首先該模型是心肌梗死后心力衰竭的慢性階段；其次動物疾病模型較單純，與臨床病人相比沒有高血壓、高血脂等混雜因素的影響；另外機(jī)體有強(qiáng)大的代償功能，神經(jīng)體液等一系列的調(diào)節(jié)作用可能在維持機(jī)體的腦血流穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)中，主要作用是合成一氧化氮(nitric oxide，NO)，其有3種同工酶。與血管收縮和舒張相關(guān)的主要是eNOS和iNOS。正常情況下主要以eNOS為主，以eNOS來源的NO具有保護(hù)內(nèi)皮和擴(kuò)張血管作用，也有神經(jīng)保護(hù)作用；而損傷后誘導(dǎo)表達(dá)的iNOS，其來源的NO會加重氧化應(yīng)激，損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，同時可介導(dǎo)遲發(fā)型神經(jīng)損傷。而eNOS/iNOS比值的降低可反映內(nèi)皮功能受損和功能下降[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性心力衰竭大鼠的大腦皮質(zhì)eNOS表達(dá)含量有下降趨勢，eNOS/iNOS明顯降低，提示心力衰竭大鼠的內(nèi)皮功能受損和功能障礙。但盡管如此，由于機(jī)體的代償功能仍然可以保持整體腦部血流量處于正常范圍。

雖然心力衰竭后大鼠的腦血流量變化并不明顯，但心力衰竭大鼠仍存在明顯的記憶能力下降等認(rèn)知功能障礙表現(xiàn)，根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)分析，可能與以下因素有關(guān)。心力衰竭時心臟分泌大量的炎性細(xì)胞因子，其可通過改變神經(jīng)可塑性和抑制學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的神經(jīng)傳導(dǎo)來降低動物的認(rèn)知功能[17]。此外，心力衰竭時缺氧所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)會引起淀粉前體樣蛋白的增加進(jìn)而導(dǎo)致記憶功能衰退[18]。本課題之前的研究也發(fā)現(xiàn)慢性心力衰竭階段腦葡萄糖代謝明顯降低。

本研究通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支制作心肌梗死后慢性心力衰竭模型，評價(jià)其認(rèn)知功能和大腦血流量變化，發(fā)現(xiàn)慢性心力衰竭大鼠存在明顯的認(rèn)知功能障礙，主要表現(xiàn)為記憶力下降。盡管慢性心力衰竭大鼠NOS系統(tǒng)異常、內(nèi)皮功能障礙，但其腦部血流量變化并不明顯。提示心臟對腦功能的影響是一個復(fù)雜的過程，血流只是影響因素之一，即使腦血流沒有變化，慢性心力衰竭大鼠仍出現(xiàn)了認(rèn)知功能損害。因此，心臟對大腦影響的研究還需要新的視角和新的方法，才能闡明心血管疾病導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的病理機(jī)制，也為中醫(yī)“心主神明”理論提供科學(xué)依據(jù)。