糞大腸菌群酶底物法在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用研究

文_黃瑾璟 紹興市環(huán)境監(jiān)測中心站

糞大腸菌群通?？稍?4～45℃下生長，其也被稱為耐熱大腸菌群，該菌群普遍來源于人畜的糞便，能夠傳播腸道傳染病，同時其也是水質(zhì)污染監(jiān)測中的一項十分重要的指標。酶底物法是一種全新的大腸桿菌群監(jiān)測方法，這種方法具有諸多優(yōu)勢，可充分反映及監(jiān)測水中的糞便污染情況，從而控制流行病的傳播。

1 研究背景

水體微生物污染情況非常嚴重，而糞便污染則是造成微生物污染的主要來源，糞便當中有諸多的病原微生物、病毒和原生動物蠕蟲，上述污染源能夠引起腸道傳染疾病的廣泛傳播。人們普遍應(yīng)用糞大腸桿菌群來評價水體的污染狀況，從而了解水質(zhì)對人體健康的影響程度。這其中糞大腸菌群具有較強的代表性，故而其在國內(nèi)的諸多標準當中都得到了非常廣泛的應(yīng)用。從檢測角度來看，使用糞大腸桿菌群酶底物法進行水質(zhì)監(jiān)測，對科研探究有著及其重要的作用，其具有快速和方便等諸多優(yōu)勢。

2 酶底物法概述

酶底物法主要利用大腸菌群生長中所產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶，分解培養(yǎng)液中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷和β-葡萄糖醛酸，從而使培養(yǎng)液出現(xiàn)色變，呈現(xiàn)黃色，并發(fā)生熒光反應(yīng)來完成檢測工作，最后以陽性組合為基礎(chǔ)，查閱MPN表得出最終的數(shù)量。在操作中，首先應(yīng)結(jié)合水樣的污染程度稀釋待測水樣，之后再取100ml的混濁水樣，將其放置在無菌瓶當中，加入1份柯麗德試劑，將其溶解并混合均勻，然后將其倒入97孔定量盤，同時還要進行封口處理。在44.3～44.7℃的培養(yǎng)箱當中培養(yǎng)，時間為24h，結(jié)合其陽性孔數(shù)查閱MPN表，對其進行精確計算。

酶底物法最初在美國出現(xiàn)，之后逐漸被推廣使用，如今采用這種檢測方法檢測糞大腸菌群、總大腸桿菌群以及大腸艾希氏菌也獲得了有關(guān)部門和機構(gòu)的認證，在美國、歐洲及日本等多個地區(qū)都得到了十分廣泛的應(yīng)用。而在我國提出的生活飲水衛(wèi)生標準當中，也將這種方法作為檢測總大腸桿菌群的標準方法，但是酶底物法還沒有成為糞大腸菌群監(jiān)測的標準方法。

3 酶底物法與其它方法的比較分析

國內(nèi)的糞大腸菌群檢測普遍應(yīng)用國外早期的檢驗方法，主要采用MPN法和濾膜法。而微生物監(jiān)測技術(shù)在不斷發(fā)展和完善，在監(jiān)測的過程中也出現(xiàn)了紙片法、固定酶底物法以及生物學(xué)鑒定法，這些方法也得到了相對較為廣泛的應(yīng)用。以下將對酶底物法與其他的檢測方法在操作難度、場所人員要求、是否需要確認實驗、檢測時間、檢測的準確性、檢測費用和推廣難度方面進行簡要的對比分析。

發(fā)酵法和濾膜法操作較為繁瑣，對場所和人員的專業(yè)性要求較高，同時需要確認試驗，檢測的時間較長，通常需要48～72h，且檢驗的結(jié)果比較準確，檢驗的費用不高，因此也更容易推廣。

酶底物法和紙片法操作較為簡單，且對場所和人員無十分嚴格的要求，且檢測的結(jié)果比較準確，酶底物法不需要確認實驗，其檢測的時間一般為24h，檢測的費用較高，但因為其檢測效果好，推廣相對容易。不僅如此，紙片法需要確認實驗，其檢測的時間一般在16～18h之間，檢測費用較低，故而推廣較為方便。

聚合酶鏈式技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)操作相對繁瑣，對場所和人員的專業(yè)性有著極高的要求，不需要進行確認實驗，檢測費用較高，雖然其檢測結(jié)果十分準確，但是由于其在費用、操作和場所人員等方面的要求比較高，所以推廣難度相對較大。

酶底物法取樣加藥后就可以封口培養(yǎng)，操作流程相對簡單，且不會出現(xiàn)嚴重的污染現(xiàn)象，雖然紙片法在操作上也比較便捷，但是在操作過程中受外界因素影響較大，需要確認實驗，而酶底物法的查表結(jié)果更加精確，其在糞大腸菌群檢測過程中假陽性和陰性現(xiàn)象不多，因此酶底物法的準確性更高，綜合性更強。

4 酶底物法的研究現(xiàn)狀

酶底物法在美國首次出現(xiàn)并應(yīng)用，這種方法測定糞大腸菌群已經(jīng)獲得EPA的認證，在多個地區(qū)都得到了非常好的應(yīng)用。雖然這種方法并沒有成為我國糞大腸菌群的標準檢測方法，但是學(xué)者也對其進行了大量的研究。部分研究人員對固定底物酶底法和多管發(fā)酵法檢測糞大腸菌群進行了比較，兩種方法檢測的結(jié)果一致。

此外，一些研究人員在多組數(shù)據(jù)對比后，證明DST-酶底物法與多管發(fā)酵法在檢測糞大腸菌群的結(jié)果相同。研究人員認為固定底物酶底物法與多管發(fā)酵法在本質(zhì)上并無差別。一些研究人員采用酶底物法對稀釋后的地表水水樣進行了培養(yǎng)和檢測，檢測后發(fā)現(xiàn)水樣稀釋數(shù)據(jù)越精確，檢測結(jié)果的準確性也就越高。同時酶底物法還成為了地震災(zāi)害中，居民生活飲用水供水安全檢測的主要方法，而且在應(yīng)急監(jiān)測中也具有十分積極的作用。所以說酶底物法是評價水質(zhì)微生物污染的一種有效且迅速的檢測方法。

5 酶底物法應(yīng)用前景分析

與其它的糞大腸菌群檢測方法相比，酶底物法的操作更加便捷，檢測結(jié)果的準確性更高，檢測速度也更快，相信這種檢測方法在日后的環(huán)境監(jiān)測當中會具有十分廣闊的應(yīng)用及發(fā)展空間。

首先，在我國環(huán)境監(jiān)測工作中，糞大腸菌群是非常重要的衛(wèi)生學(xué)指標，而且采用酶底物法檢測糞大腸菌群能夠充分順應(yīng)檢測技術(shù)發(fā)展的要求。

其次，當前我國主要應(yīng)用傳統(tǒng)的糞大腸菌群檢測方法，操作的過程相對較為復(fù)雜，同時檢測中所需要的時間也比較長，很多方法需要48～72h才能獲得最終的檢測結(jié)果，另外其對檢測條件及檢測者的技術(shù)能力也提出了十分嚴格的要求。在保存水樣的過程中，對水樣保存的條件有著非常細致且嚴格的要求，故而在我國中西部地區(qū)，傳統(tǒng)的檢測方法并不能得到廣泛的應(yīng)用，而這也影響了我國中西部地區(qū)衛(wèi)生檢測工作的質(zhì)量和水平。

再次，在糞大腸菌群檢測的過程中，采用酶底物法具有非常明顯的優(yōu)勢，這種方法檢測速度快，且檢測結(jié)果的準確性較高。在檢測中不需要清洗玻璃器皿，對檢測環(huán)境沒有十分嚴格的要求。檢測可在非無菌環(huán)境下進行，與此同時，檢測中也不需要專門配置培養(yǎng)基。在24h之內(nèi)就可以對其進行定量檢測，故而這種方法的應(yīng)用也大大減少了糞大腸菌群檢測的工作壓力。另外，采用這種檢測方法還可規(guī)避多管發(fā)酵法中逐級稀釋所產(chǎn)生的操作誤差，很好地防止了檢測過程中由于人為因素所造成的肉眼可見的誤差，這使得人們可以更加清晰且準確地了解到水質(zhì)污染的具體情況。

現(xiàn)階段，國內(nèi)所采用的糞大腸菌群檢測標準沒有對酶底物法的使用做出非常細致的規(guī)定，但是在西方很多發(fā)達國家當中，酶底物法已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于糞大腸菌群的檢測工作當中，且這種檢測方法也獲得了良好的應(yīng)用效果。國際上的多家機構(gòu)已經(jīng)充分認可了酶底物法在糞大腸菌群檢測中的作用和價值。因此，在國內(nèi)糞大腸菌群檢測的過程中，也應(yīng)正確認識到時代發(fā)展的基本趨勢，將酶底物法應(yīng)用到糞大腸菌群檢測工作中，使其充分發(fā)揮自身的作用，進而有效保證我國糞大腸菌群檢測的科學(xué)性與準確性。

6 結(jié)語

酶底物法通常借助糞大腸菌群中的特殊性酶與特殊性底物發(fā)生反應(yīng)，觀察顏色的變化和熒光反應(yīng)，從而判斷最終的檢測結(jié)果。酶底物法在應(yīng)用的過程中優(yōu)勢明顯，其操作便捷，結(jié)果非常直觀可靠，具有較強的準確性和客觀性。但是這種檢測方法也存在著非常明顯的不足。操作中所使用的培養(yǎng)基均為國外生產(chǎn)，需要較高的費用投入。所以我們應(yīng)加大科研力度，讓酶底物法培養(yǎng)基能夠在國內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)，進而有效降低檢測費用，拓展該檢測方式的應(yīng)用范圍，使其在水質(zhì)微生物污染評價中以及日常應(yīng)急監(jiān)測中，全面發(fā)揮出其積極作用。