miR-186介導(dǎo)的PTTG1下調(diào)對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響研究

余洋 劉斌波 熊飛

膀胱癌是臨床上常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)首位[1]。同其他惡性腫瘤一樣，其發(fā)生、發(fā)展涉及癌基因激活、抑癌基因失活等系列復(fù)雜過(guò)程[2-4]。而微小核糖核酸(microRNA, miRNA)通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平降解mRNA分子或抑制其表達(dá)參與腫瘤生成、細(xì)胞凋亡、發(fā)育調(diào)控、器官形成、新陳代謝等[5-7]。它在進(jìn)化上高度保守，是一種長(zhǎng)度約19～24 nt的短序RNA，本身不具有蛋白編碼功能。作為其重要成員的miR-186定位于人類1號(hào)染色體，前體序列長(zhǎng)約70 nt，其與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Yao等[8]的研究顯示，在膀胱癌組織和細(xì)胞系中，miR-186表達(dá)下調(diào)，可靶向抑制核小體結(jié)合蛋白1的表達(dá)進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力。Yang等[9]的研究顯示，miR-186可通過(guò)下調(diào)磷酸化的蛋白質(zhì)磷酸酶1B而影響膀胱癌細(xì)胞周期進(jìn)展。另有He等[10]的研究顯示，miR-186可通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C調(diào)控膀胱癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力?？梢?，其參與膀胱癌的發(fā)生、進(jìn)展和結(jié)局調(diào)控，但其具體信號(hào)通路或機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1(pituitary tumor transforming gene 1, PTTG1)由Pei等[11]于1997年在大鼠垂體腫瘤組織中首次發(fā)現(xiàn)，1999年Zhang等[12]首次將其從人胚胎干細(xì)胞中分離。后續(xù)研究證實(shí)PTTG家族至少包括PTTG1、PTTG2和PTTG3 3個(gè)成員。而人體腫瘤中主要表達(dá)PTTG1，其具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成、導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能[13-16]。多項(xiàng)研究表明，在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤組織和細(xì)胞系中PTTG1表達(dá)升高，且與這些惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后等密切相關(guān)，可能成為重要的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[17-20]。但目前PTTG1在膀胱癌中的研究相對(duì)較少。Xiang等[21]的研究提示，miR-146a-3p可調(diào)控PTTG1的表達(dá)，促進(jìn)膀胱癌的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)。關(guān)于miR-186和PTTG1在膀胱腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況及其靶向關(guān)系，以及兩者對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移影響的研究也甚少。

本研究采用qRT-PCR檢測(cè)50例膀胱癌及相應(yīng)的癌旁組織中miR-186和PTTG1核酸含量，Western blotting檢測(cè)PTTG1蛋白含量，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-186和PTTG1結(jié)合位點(diǎn)，并利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩者的靶向關(guān)系。為了證實(shí)miR-186是否通過(guò)靶向調(diào)控PTTG1而影響膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，我們將miR-186抑制物或miR-186抑制物+設(shè)計(jì)合成的PTTG1特異性siRNA轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞J82，觀察抑制miR-186或同時(shí)抑制miR-186和PTTG1后細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的變化，同時(shí)監(jiān)測(cè)PCNA、Bcl-2、Bax、MMP-2和E-cadherin以探討其對(duì)上述各信號(hào)分子的作用，以期加深對(duì)膀胱癌發(fā)生、發(fā)展及結(jié)局機(jī)制的了解，為膀胱癌早期診療、基因治療及預(yù)后判斷提供更多理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.膀胱癌組織來(lái)源：收集2017年7月至2018年6月期間在宜昌市中心人民醫(yī)院泌尿外科行膀胱全切術(shù)的膀胱癌患者癌組織標(biāo)本共計(jì)50例，詳細(xì)記錄手術(shù)時(shí)間、年齡、性別、病理資料等。所有患者術(shù)前均未行放、化療和免疫治療。其中男32例，女18例；年齡39～80歲，平均年齡(60.02±7.51)歲。行膀胱全切術(shù)時(shí)，同時(shí)取距離腫瘤組織2 cm以上區(qū)域的正常膀胱組織(癌旁組織)。所有標(biāo)本的采集經(jīng)過(guò)醫(yī)院允許，術(shù)前所有患者簽訂《標(biāo)本處理知情同意書》，并自愿提供膀胱組織標(biāo)本。

2.膀胱癌細(xì)胞來(lái)源：膀胱癌J82細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，按照細(xì)胞的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。

3.主要試劑和儀器：總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒，購(gòu)自大連TAKARA公司；BCA試劑盒、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、ECL試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；小鼠抗人PTTG1抗體，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；PVDF膜、ECL增強(qiáng)發(fā)光液，購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)BioAssay Systems公司；Lipofectamine 2000試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；MTT細(xì)胞活性檢測(cè)試劑，購(gòu)自中國(guó)碧云天生物科技有限公司；Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒、基質(zhì)膠，購(gòu)自美國(guó)BD公司；Transwell小室，購(gòu)自美國(guó)Coring公司；鼠抗人PCNA、Bcl-2、Bax、MMP-2和E-cadherin抗體，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；電泳儀、紫外分光光度計(jì)，購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)、垂直型蛋白電泳裝置，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；PCR儀、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；大型臺(tái)式恒溫?fù)u床，購(gòu)自美國(guó)NBS公司；酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀，購(gòu)自美國(guó)BD公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)板，購(gòu)自上海生化試劑儀器公司；倒置熒光顯微鏡，購(gòu)自日本Olympus公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.膀胱癌組織和細(xì)胞系中miR-186和PTTG1核酸含量及蛋白水平測(cè)定：選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的膀胱癌細(xì)胞，依據(jù)總RNA提取試劑盒的說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的RNA濃度，測(cè)定260 nm和280 nm處的光密度(optical density,OD)值的比值(OD260/OD280)，估計(jì)核酸的純度，OD260/OD280為1.8～2.0的RNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)合格的RNA放置在-80 ℃冰箱中保存。依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃，60 min；85 ℃，5 min；4 ℃，終止反應(yīng)。將cDNA模板放于-20 ℃冰箱中保存。依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，引物序列如下：miR-186引物(上游-5′-CCCGATAAAG-CTAGATAACC-3′，下游-5′-CAGTGCGTGTCGT-GGAGT-3′)；內(nèi)參U6引物(上游-5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游-5′-CAG-TGCGTGTCGTGGAGT-3′)；PTTG1引物(上游-5′-TGATCCTTGACGAGGGAG-3′，下游-5′-GGT-GGCAATTCAACATCCAGG-3′)；內(nèi)參GAPDH引物(上游-5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTT-3′，下游-5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′)。反應(yīng)體系：總RNA 1 μg，5×緩沖液 4 μl， 反轉(zhuǎn)錄酶混合物 1 μl，引物混合物 1 μl，去離子水補(bǔ)足至25 μl。反應(yīng)條件：37 ℃，60 min；85 ℃，5 min，反應(yīng)終止后，將cDNA模板放置于-20 ℃冰箱中保存。然后根據(jù)不同反應(yīng)條件進(jìn)行定量擴(kuò)增，最后針對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號(hào)定量分析，以所得溶解曲線及Ct值，按照公式2-△△Ct計(jì)算miR-186(以U6為內(nèi)參)和PTTG1(以GAPDH為內(nèi)參)的表達(dá)量，其中△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。選取備用組織和細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰盒中裂解反應(yīng)30 min，12 000 rpm，4 ℃離心10 min，取上清至離心管中，部分用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，剩余放置于-20 ℃冰箱保存。BCA法定量蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，膜封閉和一、二抗體孵育過(guò)程。再應(yīng)用 ECL顯色液顯色，Image J軟件分析圖像。蛋白相對(duì)表達(dá)量為目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值。

2.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：通過(guò)TargetScan、miRBase和miRanda生物信息學(xué)分析軟件發(fā)現(xiàn)miR-186和PTTG1存在可結(jié)合的位點(diǎn)。24孔板中培養(yǎng)膀胱癌J82細(xì)胞，將構(gòu)建的miR-186 mimics與PmiR-GLO-PTTG1-3′UTR共轉(zhuǎn)染至J82細(xì)胞中，PTTG1基因的3′UTR 區(qū)克隆至載體海腎熒光素酶基因下游位點(diǎn)。構(gòu)建結(jié)合miR-186 mimics與對(duì)照(miR-scramble)的野生型(WT)報(bào)告質(zhì)粒及突變型(MUT)報(bào)告質(zhì)粒。依照Lipofectamine 2000試劑盒說(shuō)明，轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的質(zhì)粒至J82細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，分別以海腎熒光素酶基因及螢火蟲熒光素酶作為內(nèi)參基因和報(bào)告基因，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：使用MTT試劑檢測(cè)J82細(xì)胞活力。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×104個(gè)/ml。在96孔板中加入細(xì)胞懸液，每孔100 μl，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置加入培養(yǎng)液的孔為零孔。分別收集培養(yǎng)24、48、72和96 h的細(xì)胞，避光條件下在每孔中加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，培養(yǎng)箱中放置4 h，將孔內(nèi)液體吸出，再在每孔中加入DMSO溶液150 μl，搖床低速震蕩10 min，結(jié)晶完全溶解后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處各組各個(gè)孔的OD值，記錄結(jié)果，取均值。以所測(cè)的時(shí)間為橫坐標(biāo)，檢測(cè)的OD值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將J82細(xì)胞分為anti-NC組、anti-miR-186組和anti-miR-186+si-PTTG1組。胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml。取200 μl細(xì)胞懸液，接種于Transwell小室的上室，然后沿小室外側(cè)孔緩慢的加入600 μl含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液。依據(jù)細(xì)胞遷移能力不同，調(diào)整細(xì)胞遷移時(shí)間，到達(dá)時(shí)間后，從培養(yǎng)箱中將小室取出，棉簽輕輕拭去培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)液，小室放于多聚甲醛(4%)中固定，20 min后，使用棉簽將多聚甲醛拭去。轉(zhuǎn)移小室至結(jié)晶紫液中，避光染色25 min。沖洗掉結(jié)晶紫液，棉簽擦干小室。顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野(上、中、下、左、右)，計(jì)數(shù)，記錄數(shù)據(jù)。取均值，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

5.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：鋪板前1 h，將基質(zhì)膠于4 ℃環(huán)境解凍，24孔板4 ℃提前預(yù)冷。取100 μl基質(zhì)膠平鋪在Transwell小室的上室，37 ℃條件下放置過(guò)夜，使基質(zhì)膠能聚合成凝膠。按照3∶1比例將無(wú)血清培養(yǎng)液與基質(zhì)膠混勻，取稀釋后的基質(zhì)膠40 μl，鋪在Transwell小室上室，4 ℃環(huán)境放置30 min，然后轉(zhuǎn)移至37 ℃放置1～2 h。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

6.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：采用Annexin Ⅴ-FITC雙染法，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理與分析，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，使用單因素方差分析及t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、miR-186和PTTG1在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)

為選擇最適宜的用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的膀胱癌細(xì)胞系，本研究以人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1為對(duì)照，檢測(cè)了膀胱癌J82、T24、HT1376和RT4細(xì)胞miR-186和PTTG1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，SV-HUC-1、J82、T24、HT1376和RT4細(xì)胞miR-186 mRNA表達(dá)水平分別為1.000±0.019、0.189±0.022、0.255±0.031、0.416±0.042、0.527±0.056，PTTG1 mRNA表達(dá)水平分別為1.000±0.057、7.112±0.531、5.987±0.501、5.112±0.311、4.121±0.325，PTTG1相對(duì)蛋白表達(dá)水平分別為0.081±0.013、0.652±0.059、0.448±0.052、0.372±0.043、0.187±0.027，與SV-HUC-1細(xì)胞比較，miR-186 mRNA表達(dá)降低，PTTG1 mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

A、B：qRT-PCR檢測(cè)不同膀胱癌細(xì)胞miR-186和PTTG1表達(dá)水平；C：Western blotting檢測(cè)不同膀胱癌細(xì)胞PTTG1表達(dá)；D：不同膀胱癌細(xì)胞PTTG1相對(duì)蛋白表達(dá)量(與SV-HUC-1細(xì)胞比較 * P<0.05)圖1 不同膀胱癌細(xì)胞中miR-186和PTTG1表達(dá)水平

二、雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果

生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示miR-186和PTTG1存在可結(jié)合位點(diǎn)(圖2A)。為了證實(shí)miR-186和PTTG1之間是否存在靶向關(guān)系，構(gòu)建含結(jié)合位點(diǎn)的PTTG1-WT和PTTG1-MUT質(zhì)粒，并與miR-186共轉(zhuǎn)染J82細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶活性檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性。結(jié)果顯示，miR-186 mimics與PTTG1-WT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后相對(duì)熒光素酶活性為0.302±0.046，miR-scramble與PTTG1-WT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后相對(duì)熒光素酶活性為1.000±0.034，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-186 mimics與PTTG1-MUT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后相對(duì)熒光素酶活性與miR-scramble+PTTG1-MUT組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2B。

A：miR-186和PTTG1的結(jié)合位點(diǎn)；B：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTTG1-WT/MUT與miR-186 mimics共轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性(與miR-scramble組比較 * P<0.05)圖2 miR-186和PTTG1的結(jié)合位點(diǎn)及雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)熒光素酶活性

三、抑制miR-186表達(dá)減弱PTTG1下調(diào)對(duì)J82細(xì)胞增殖的影響

將miR-186抑制物轉(zhuǎn)染J82細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-186的表達(dá)，結(jié)果顯示，anti-miR-186轉(zhuǎn)染J82細(xì)胞后，miR-186表達(dá)水平為0.351±0.045，其表達(dá)水平明顯低于anti-NC組(1.111±0.026)(P<0.05)。將J82細(xì)胞分為anti-NC組、anti-miR-186組和anti-miR-186+si-PTTG1組，通過(guò)MTT法檢測(cè)抑制miR-186和同時(shí)抑制miR-186、PTTG1表達(dá)后J82細(xì)胞增殖能力的變化。結(jié)果顯示，與anti-NC組比較，anti-miR-186組在轉(zhuǎn)染后24～96 h的增殖能力均明顯升高(P<0.05)；而與anti-miR-186組比較，anti-miR-186+si-PTTG1組在轉(zhuǎn)染后24～96 h的增殖能力均明顯降低(P<0.05)。見圖3、表1。

A：anti-miR-186轉(zhuǎn)染后的J82細(xì)胞中miR-186表達(dá)；B：抑制miR-186和PTTG1表達(dá)后J82細(xì)胞OD值變化(與anti-NC組比較 * P<0.05；與anti-miR-186組比較 # P<0.05)圖3 抑制miR-186和PTTG1表達(dá)后J82細(xì)胞增殖曲線

組別24 h48 h72 h96 hanti-NC組0.323±0.0350.529±0.0570.838±0.0760.918±0.083anti-miR-186組0.555±0.048?0.772±0.063?1.088±0.086?1.222±0.092?anti-miR-186+si-PTTG1組0.417±0.035#0.628±0.058#0.901±0.087#1.011±0.074#

與anti-NC組比較*P<0.05；與anti-miR-186組比較#P<0.05

四、抑制miR-186表達(dá)減弱PTTG1下調(diào)對(duì)J82細(xì)胞侵襲和遷移的影響

Transwell小室檢測(cè)抑制miR-186和同時(shí)抑制miR-186、PTTG1表達(dá)后J82細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目的變化。結(jié)果顯示，anti-NC組、anti-miR-186組和anti-miR-186+si-PTTG1組J82細(xì)胞侵襲數(shù)分別為(122.5±4.9)、(172.9±6.2)和(144.4±4.2)個(gè)，遷移細(xì)胞數(shù)分別為(152.8±6.1)、(214.3±7.9)和(182.4±6.8)個(gè)。與anti-NC組比較，anti-miR-186組細(xì)胞侵襲及遷移數(shù)明顯升高(P<0.05)；與anti-miR-186組比較，anti-miR-186+si-PTTG1組細(xì)胞侵襲及遷移數(shù)明顯降低(P<0.05)。見圖4。

A：Transwell小室檢測(cè)抑制miR-186和PTTG1表達(dá)后J82細(xì)胞侵襲變化；B：Transwell小室檢測(cè)抑制miR-186和PTTG1表達(dá)后J82細(xì)胞遷移變化(與anti-NC組比較 * P<0.05；與anti-miR-186組比較 # P<0.05)圖4 抑制miR-186和PTTG1表達(dá)后J82細(xì)胞侵襲和遷移變化

五、抑制miR-186表達(dá)減弱PTTG1下調(diào)對(duì)J82細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抑制miR-186和同時(shí)抑制miR-186、PTTG1表達(dá)后J82細(xì)胞凋亡率的變化，結(jié)果顯示，anti-NC組、anti-miR-186組和anti-miR-186+si-PTTG1組細(xì)胞凋亡率分別為(26.41±1.52)%、(11.13±0.86)%和(20.20±1.45)%。與anti-NC組比較，anti-miR-186組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；與anti-miR-186組比較，anti-miR-186+si-PTTG1組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見圖5。

A：Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法檢測(cè)抑制miR-186和PTTG1表達(dá)后J82細(xì)胞凋亡情況；B：各組細(xì)胞的凋亡率(與anti-NC組比較 * P<0.05；與anti-miR-186組比較 # P<0.05)圖5 抑制miR-186和PTTG1表達(dá)后J82細(xì)胞凋亡率的變化

六、抑制miR-186表達(dá)減弱PTTG1下調(diào)對(duì)J82細(xì)胞PCNA、Bcl-2、Bax、MMP-2和E-cadherin表達(dá)的影響

抑制miR-186和同時(shí)抑制miR-186、PTTG1表達(dá)后，Western blotting檢測(cè)J82細(xì)胞中PCNA、Bcl-2、Bax、MMP-2和E-cadherin的表達(dá)，結(jié)果顯示，anti-NC組、anti-miR-186組和anti-miR-186+si-PTTG1組PCNA蛋白表達(dá)分別為 0.104±0.013、0.655±0.071、0.312±0.034，Bax/Bcl-2比例分別為3.556±0.123、0.216±0.023、0.678±0.051，MMP-2蛋白表達(dá)分別為 0.078±0.010、0.289±0.032、0.163±0.015，E-cadherin蛋白表達(dá)分別為 0.499±0.051、0.124±0.018、0.266±0.030。與anti-NC組比較，anti-miR-186組細(xì)胞PCNA和MMP-2表達(dá)明顯升高，Bax/Bcl-2比例和E-cadherin表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與anti-miR-186組比較，anti-miR-186+si-PTTG1組細(xì)胞PCNA和MMP-2表達(dá)明顯降低，Bax/Bcl-2比例和E-cadherin表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見圖6。

討 論

近年來(lái)，膀胱癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著膀胱癌患者的生命健康。目前，膀胱癌的主要治療途徑為手術(shù)切除、輔助免疫治療及放、化療，但治療效果并不理想[22]。

miRNA發(fā)揮癌基因或原癌基因活性主要通過(guò)與靶基因相互作用實(shí)現(xiàn)，對(duì)于miRNA靶基因研究一直是miRNA研究中的一個(gè)重點(diǎn)和熱點(diǎn)，只有明確了miRNA的靶基因，才能揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中miRNA發(fā)揮作用的機(jī)制。PTTG1是一種原癌基因，黃慶鋒[23]的研究發(fā)現(xiàn)，PTTG1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平隨惡性程度增加而升高，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中PTTG1也呈現(xiàn)高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤分級(jí)呈正相關(guān)，抑制PTTG1表達(dá)可降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力，miRNA干擾PTTG1表達(dá)可明顯降低Ki-67及c-myc表達(dá)，降低細(xì)胞增殖能力。Wang等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-655可通過(guò)靶向PTTG1抑制食管癌侵襲能力。以上研究提示miRNA可通過(guò)對(duì)PTTG1的調(diào)節(jié)來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。另有研究表明，miR-186-5p可通過(guò)靶向抑制PTTG1降低肺腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力，抑制細(xì)胞EMT發(fā)生[25]；miR-186可靶向PTTG1參與結(jié)直腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的浸潤(rùn)和侵襲[26]。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們收集了50例膀胱癌及癌旁組織標(biāo)本，qRT-PCR檢測(cè)顯示，miR-186在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，qRT-PCR及Western blotting檢測(cè)PTTG1表達(dá)結(jié)果顯示，膀胱癌組織中PTTG1表達(dá)明顯高于癌旁組織。多個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件找到miR-186和PTTG1的結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-186和PTTG1確實(shí)存在靶向關(guān)系。

PCNA是一種分子量為36 kD的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞核內(nèi)合成，并存在于細(xì)胞核，在DNA鏈損傷、修復(fù)及復(fù)制等多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮作用，其表達(dá)水平隨細(xì)胞周期改變而變化，與惡性腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等存在密切關(guān)系，是一個(gè)可反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的理想標(biāo)志物，在多種腫瘤研究中應(yīng)用廣泛[27-28]。

EMT是一種生物學(xué)現(xiàn)象，為上皮細(xì)胞歷經(jīng)復(fù)雜生化改變后獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展、組織纖維化及慢性炎癥。大量研究發(fā)現(xiàn)，EMT與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系，惡性腫瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞可通過(guò)EMT過(guò)程而得到轉(zhuǎn)移能力[29-30]。E-cadherin是一個(gè)經(jīng)典的上皮細(xì)胞分子標(biāo)志物，在維持組織完整性及上皮細(xì)胞極性過(guò)程中發(fā)揮重要作用。E-cadherin表達(dá)降低或丟失可使腫瘤上皮細(xì)胞極性消失，細(xì)胞間黏附性降低，從而使細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。

凋亡過(guò)程的啟動(dòng)可對(duì)細(xì)胞“命運(yùn)”產(chǎn)生直接影響，在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，Bcl-2家族成員比例是調(diào)控細(xì)胞凋亡的一個(gè)關(guān)鍵因素，尤其是Bcl-2家族成員抑凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax，兩者比例是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”，Bcl-2和Bax通過(guò)形成同源二聚體或異源二聚體發(fā)揮細(xì)胞凋亡調(diào)控作用，Bax與Bcl-2產(chǎn)生異源二聚體時(shí)，細(xì)胞凋亡受到抑制，當(dāng)Bax同源二聚體形成時(shí)，可引起細(xì)胞凋亡發(fā)生[31-32]。Bcl-2和Bax常用于細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究，大量研究表明，腫瘤細(xì)胞凋亡與Bcl-2和Bax表達(dá)密切相關(guān)[33-34]。

為了進(jìn)一步證實(shí)miR-186靶向PTTG1對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，使用miR-186抑制物或miR-186抑制物和miR-186 siRNA同時(shí)處理J82細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制miR-186表達(dá)可明顯增強(qiáng)J82細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，抑制細(xì)胞凋亡，上調(diào)PCNA、Bcl-2和MMP-2表達(dá)，下調(diào)Bax和E-cadherin表達(dá)，且減弱PTTG1會(huì)下調(diào)對(duì)J82細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。提示miR-186可靶向PTTG1影響膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)。通過(guò)以上研究，可為膀胱癌早期診療、基因治療及預(yù)后判斷提供新的策略和理論依據(jù)。