有機磷農(nóng)藥廣譜降解菌A1A18菌株(Brevundimonas sp.)的篩選、鑒定與降解特性分析

顧 欣，劉文輝，楊環(huán)羽，柳強娟，孫 權，王 銳，王新譜

(寧夏大學 農(nóng)學院，銀川 750021)

有機磷農(nóng)藥(Organophosphorus pesticide,OP)是應用最廣的一類有機農(nóng)藥[1]，其毒性給人類、其他生物和環(huán)境帶來一系列問題[2]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的OP大部分進入耕作環(huán)境，其中土壤是農(nóng)藥殘留累積的主要場所。由于農(nóng)藥自身物理化學性質(zhì)、使用頻次和土壤環(huán)境的差異，不同OP的自然降解過程長短不一，從數(shù)天到數(shù)百天[3-4]。為了避免土壤農(nóng)藥殘留過量累積對人類和環(huán)境造成更大的危害，研究OP的加速降解技術迫在 眉睫。

目前，OP的降解主要有微生物降解、光降解和氧化降解3個途徑[5]。其中，微生物降解方法以其環(huán)境友好、無二次污染、使用便捷等優(yōu)點而獲得人類的青睞。因此，具有OP降解功能的微生物研究成為熱點。目前，已知多種OP降解菌，如假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)等微生物，都是針對某種單一OP進行定向篩選分離獲得的[6-8]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中，由于耕作方式和環(huán)境變化導致不同害蟲在同一田塊中發(fā)生，造成不同種類的OP同時或先后被施用并累積于土壤。因此，篩選對多種OP都具有降解能力的廣譜降解菌，有利于提高農(nóng)田土壤修復效率，同時降低修復成本。部分學者在這方面開展了研究，如Pino等[9]通過選擇富集法，從農(nóng)藥污染土壤中獲得對毒死蜱和甲基對硫磷都具有較好降解效果的菌系。某些真菌，如淡紫青霉(Penicilliumlilacinum)BP303菌株產(chǎn)生的酶可以使OP的P-O和PS鍵發(fā)生裂解，從而具有同時降解對氧磷、對硫磷、甲基對硫磷的功能，其中對氧磷是該菌株的優(yōu)選底物[10]。3株蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)對毒死蜱、甲基對硫磷和三唑磷具有不同的降解能力[11]。1株施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)對甲基對硫磷具有較高降解率，對氧化樂果、甲拌磷和辛硫磷也具有一定降解效果[12]。

本研究選擇毒死蜱、氧化樂果和水胺硫磷作為目標降解物，開展OP廣譜降解菌的分離篩選和初步鑒定，確定其對不同種類農(nóng)藥的降解效果及其降解功能的遺傳穩(wěn)定性，為OP高效降解菌的進一步開發(fā)和研究提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

用于OP降解菌富集、篩選的土壤樣品采集自銀川市軍馬場農(nóng)田、銀川市區(qū)周邊農(nóng)田、賀蘭縣菜田和果園，都曾經(jīng)施用過毒死蜱、氧化樂果或水胺硫磷。取表層土5～20 cm，剔除其中的石塊、植株殘體，陰涼處攤開自然風干，過2.0 mm篩，備用。

非耕作土壤采集自銀川市軍馬場荒地，經(jīng)過預處理后，用于OP加標回收試驗及盆栽試驗。該土壤樣品質(zhì)地為砂壤，酸堿度為8.57，全鹽質(zhì)量分數(shù)為0.60 g·kg-1，有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為2.87 g·kg-1，堿解氮質(zhì)量分數(shù)為1.05 g·kg-1，速效磷質(zhì)量分數(shù)為32.32 g·kg-1，速效鉀質(zhì)量分數(shù)為203.39 g·kg-1。

1.2 有機磷農(nóng)藥

購自銀川市農(nóng)資市場，基本情況見表1。

表1 有機磷農(nóng)藥基本情況Table 1 Organophosphorus pesticides

1.3 主要培養(yǎng)基和試劑

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.4，用于菌種活化。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中加瓊脂15.0～20.0 g·L-1，用于菌種保存、活化和傳代培養(yǎng)。

固體選擇培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，冷卻至約40 ℃加入試驗用OP(毒死蜱、氧化樂果或水胺硫磷，下同)，使OP終質(zhì)量濃度為1 g·L-1，用于降解菌的初篩和 純化。

液體選擇培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，冷卻至約40 ℃加入試驗用OP，使OP終質(zhì)量濃度為1 g·L-1，用于降解菌的復篩。

淀粉瓊脂培養(yǎng)基，用于淀粉水解試驗。葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，用于葡萄糖發(fā)酵試驗。葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液，用于乙酰甲基甲醇(V-P)試驗。葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，用于甲基紅試驗。檸檬酸鐵銨培養(yǎng)基，用于硫化氫試驗。硝酸鹽培養(yǎng)基，用于硝酸鹽還原試驗。營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基，用于明膠液化試驗。尿素培養(yǎng)基，用于脲酶試驗。蛋白胨水培養(yǎng)基，用于吲哚試驗。苯丙氨酸脫羧酶培養(yǎng)基，用于苯丙氨酸脫羧酶試驗[13]。

主要試劑與標準品：二氯甲烷(分析純)，石油醚(分析純)，購自國藥集團化學試劑有限公司；細菌基因組提取試劑盒和DNA片段快速回收純化試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司。其余試劑均為標準品，為毒死蜱、氧化樂果(純度99%)和水胺硫磷(純度98%)，購自寧夏恒元創(chuàng)科貿(mào)有限公司。

1.4 降解菌的富集與分離純化

采用不同的OP液體選擇培養(yǎng)基，加入質(zhì)量比為1∶100的土壤樣品，于30 ℃、200 r·min-1恒溫避光振蕩培養(yǎng)6 d。將培養(yǎng)液以φ=10%接種量轉接至新的OP液體選擇培養(yǎng)基中，使其中OP終質(zhì)量濃度逐級增加，分別為1.5、2.0、2.5、3.0 g·L-1。至培養(yǎng)結束，取培養(yǎng)液1 mL與 19 mL 50 ℃左右的OP固體選擇培養(yǎng)基混勻，冷卻制平板，于30 ℃恒溫箱避光倒置培養(yǎng)。對長出的菌落經(jīng)3次劃線分離純化，獲得純培養(yǎng)菌種，置于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.5 降解菌初篩

采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基于30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)菌種，活化18 h。搖勻后，用無菌水制備菌懸液，于37 ℃、200 r·min-1振蕩2 h，稀釋后使其中細菌終數(shù)量密度為0.2×108CFU·mL-1。采用固體平板培養(yǎng)法，在固體選擇培養(yǎng)基表面以輻射對稱方式放置8個無菌牛津杯，每個杯內(nèi)注入110 μL菌懸液。于37 ℃恒溫避光培養(yǎng)24 h，牛津杯內(nèi)的液體幾乎全部自然蒸發(fā)。取出牛津杯，于原培養(yǎng)條件倒置培養(yǎng)2～4 d，以等量無菌水為對照，每處理設5個重復。觀察牛津杯外側有無降解圈，以不同角度用游標卡尺測量降解圈外徑3次，取均值作為降解圈外徑。以降解圈外徑大小作為初篩依據(jù)，選擇降解圈最大和較大的菌株進入復篩。

1.6 降解菌復篩

活化菌種，制備菌懸液，方法同“1.5”。取 1 mL菌懸液接種于99 mL OP液體選擇培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1恒溫避光振蕩培養(yǎng)72 h，檢測其中OP殘留量。以不接種的液體選擇培養(yǎng)基為空白對照，每處理設3個重復。降解率計算公式如下：

降解率=(空白對照OP殘留量-降解菌處理OP殘留量)/空白對照OP殘留量×100%

比較各菌株對3種OP的降解率，以降解率較高的菌株作為目標菌株。

1.7 降解菌降解能力的遺傳穩(wěn)定性

活化目標菌株，方法同“1.5”。進行傳代培養(yǎng)，分別測定初始菌、第5代和第10代對3種OP的降解率，檢測方法同“1.6”。每處理設3個重復。以降解率較穩(wěn)定的菌株為OP廣譜降解菌株。

1.8 降解菌鑒定

1.8.1 形態(tài)學鑒定 采用平板劃線法活化目標菌株，牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)18 h，形成單一菌落。觀察菌落的形態(tài)、顏色、直徑大小及菌落邊緣是否整齊；經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體形態(tài)，測量長短徑，芽孢有無等。

1.8.2 生理生化鑒定 包括葡萄糖發(fā)酵試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、硫化氫試驗、吲哚試驗、甲基紅試驗和菌膜形成試驗。參照東秀珠《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行分類鑒定[13]。

1.8.3 分子鑒定 提取細菌總DNA[14]。引物為27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR 條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s， 72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃最后延伸 8 min，16 ℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測擴增效果后在10 g·L-1瓊脂糖凝膠上做電泳分析，回收 16S rDNA，委托廣州賽哲生物技術公司完成 測序。

1.8.4 系統(tǒng)發(fā)育地位確定 將測序獲得的菌株16S rDNA基因序列提交到NCBI總數(shù)據(jù)庫，經(jīng)BLAST軟件在線比對，進行同源性分析。選擇同源性關系比較近的序列，采用MEGA 5.0建立進化樹。

1.9 降解菌對土壤中OP的降解能力

1.9.1 降解菌菌懸液制備 活化降解菌，方法同“1.5”。用無菌水制備有效活菌數(shù)量密度為 1.0×108CFU·mL-1的菌懸液。

1.9.2 土壤中OP降解試驗 于避光處，在預處理后的非耕作土壤中，用小型噴霧器添加3種OP，邊噴邊攪拌，充分混勻，使土壤中3種OP原藥的質(zhì)量分數(shù)分別達到1.0 mg·kg-1干土，制成試驗用污染土。用同樣方法噴入菌懸液，攪拌均勻，使降解菌在試驗土壤中的初始數(shù)量密度為0.2×108CFU·g-1干土。立即將混勻后的土壤裝花盆?；ㄅ枭?、下口直徑分別為16.0 cm和11.0 cm，高14.0 cm，裝土量為1.0 kg。用無菌水調(diào)節(jié)土壤濕度為20%。置于溫室，正常光照，每日根據(jù)蒸發(fā)量補水。以不添加降解菌的OP污染土為對照。每處理3個重復。分別于裝盆后的0(裝盆后4 h)、1、3、5、7、14、21 d取0 ～10 cm的土樣，每處理采用多點混合，四分法取樣，用密封袋裝好，放入有冰袋的保溫箱內(nèi)，立即帶回實驗室進行OP質(zhì)量分數(shù)檢測。

1.10 菌液數(shù)量密度及土壤理化性質(zhì)檢測

菌液數(shù)量密度：采用梯度稀釋平板培養(yǎng)法。用無菌生理鹽水制備菌液的梯度稀釋液，分別取1 mL稀釋液倒入50～60 ℃、15 mL牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，立即混勻，靜置冷卻，37 ℃倒置培養(yǎng) 24 h，菌落計數(shù)。每個數(shù)量密度梯度3個重復，計算菌液的活菌數(shù)量密度。

土壤的理化性質(zhì)：采用烘干法測含水量；采用電位法測pH；采用重鉻酸鉀容量法測有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)[15]。

1.11 樣品中OP殘留量的檢測

1.11.1 OP殘留量的檢測 參照NY/T 761-2008中OP農(nóng)藥殘留的提取方法處理培養(yǎng)液樣品[16]；參照Fang等[17]的方法處理土壤樣品。采用氣相色譜分析法。儀器條件為Agilent 7980A-ECD；色譜柱為HP-5石英毛細柱，30 m×0.32 mm×0.25 μm；毒死蜱、氧化樂果檢測時的進樣口溫度220 ℃，檢測器溫度320 ℃，柱溫270 ℃；水胺硫磷檢測時的進樣口溫度220 ℃，檢測器溫度200 ℃，柱溫170 ℃；載氣均為高純氮氣(純度99.999%)，流速為1.0 mL·min-1。采用不分流進樣，進樣體積1 μL。用外標法計算樣品中OP的殘留量。

1.11.2 土壤中OP加標回收試驗 取預處理后的非耕作土壤樣品，避光稱取3種OP標品分別與之混勻，制成OP初始質(zhì)量分數(shù)分別為0.1、 0.5、1.0、5.0 mg·kg-1干土的含農(nóng)藥土壤，以不加OP為對照，每處理3個重復。按照“1.11.1”的方法檢測土壤中OP的質(zhì)量分數(shù)，分別計算3種OP的加標回收率。

1.12 統(tǒng)計分析

采用Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖；采用SPSS 17.0軟件進行方差分析，在P<0.05水平上進行差異顯著性檢驗。采用MEGA 5.0建立進化樹。

2 結果與分析

2.1 降解菌初篩

初篩共獲得菌株12株，見表2。各菌株在不同培養(yǎng)基上形成的降解圈外徑不同。牛津杯內(nèi)徑為6 mm，降解圈外徑越大，說明該菌株在相應OP選擇培養(yǎng)基上的生長狀況越好。因此，依據(jù)降解圈外徑的大小可以對各菌株的農(nóng)藥降解性能進行初步比較。試驗目標是選擇對3種OP都具有一定降解能力的菌株，故選擇3種OP培養(yǎng)基上都具有降解圈，且降解圈外徑最大和較大的菌株作為目標菌株。在毒死蜱、氧化樂果和水胺硫磷固體選擇培養(yǎng)基上的降解圈外徑最大的菌株編號分別為A1A18、A5C2和B2C6，且3個菌株對3種OP均有一定的降解能力，說明不同菌株對不同農(nóng)藥的降解性能具有差異，以這3個菌株作為目標菌株進入復篩。

表2 初篩菌株的來源土壤及其在3種OP選擇培養(yǎng)基上的降解圈外徑Table 2 Source soil and outer diameter of degradation circle of strains in three kinds of OP selection media in preliminary screening mm

注：不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:Different lowercase letters represent significant difference (P<0.05),the same below.

2.2 降解菌復篩

將初篩獲得的3個菌株在毒死蜱、氧化樂果和水胺硫磷液體選擇培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，檢測各菌株在液體環(huán)境中對農(nóng)藥的降解率，結果如圖1。3個菌株對3種OP都有一定降解能力，但降解效果具有差異。比較毒死蜱的降解率，3個菌株由高到低是A1A18、A5C2、B2C6，A1A18的降解率最高，為45.82%。比較氧化樂果的降解率，3個菌株由高到低是A5C2、A1A18、B2C6，A5C2和A1A18的降解率分別為9.90%和9.52%，其差異未達顯著水平。比較水胺硫磷的降解率，3個菌株由高到低是B2C6、A1A18、A5C2，B2C6的降解率最高，為24.64%，A5C2對水胺硫磷的降解能力很低。由此可知，在3株細菌中菌株A1A18對3種OP均具有一定的降解能力，降解率分別為45.82%、9.52%和13.96%。以菌株A1A18作為目標菌株，開展降解能力遺傳穩(wěn)定性研究。

圖1 液體培養(yǎng)條件下目標菌株對3種OP的降解率Fig.1 Degradation rate of three kinds of OP by 3 strains in liquid fermentation

2.3 A1A18菌株降解能力的遺傳穩(wěn)定性

對復篩獲得的目標菌株A1A18進行傳代培養(yǎng)。該菌株的第1、5、10代對試驗用3種OP的降解率如圖2。菌株A1A18對毒死蜱和氧化樂果的降解能力在第5、10代分別較第1代下降 1.90%～3.40%和14.18%～16.18%，但各代之間差異在統(tǒng)計學上未達顯著水平。由此可知，菌株A1A18對毒死蜱、氧化樂果和水胺硫磷的降解能力遺傳穩(wěn)定性較好。

圖2 菌株A1A18對3種OP降解能力的遺傳穩(wěn)定性Fig.2 Degradation capacity genetic stability of strain A1A18 to five kinds of OP

2.4 A1A18菌株鑒定

2.4.1 形態(tài)學鑒定 A1A18菌株在瓊脂培養(yǎng)基表面形成菌落。菌落顏色為灰白色，直徑為 0.5～0.8 cm，圓形，表面光滑，不透明，側面觀似草帽狀，中部具有凸起，邊緣較整齊具有蠟質(zhì)感。菌體為直桿狀，大小為(0.3～0.5) μm×(1.5～ 2.5) μm，具圓端，無芽孢(圖3)。

圖3 菌株A1A18的菌落形態(tài)(A)和菌體形態(tài)(B)Fig.3 Colony(A) and bacteria(B) morphology of strain A1A18

2.4.2 生理生化鑒定 依據(jù)菌株A1A18的形態(tài)特征及生理生化試驗結果(表3)進行鑒定，初步判斷該菌株與短波單胞菌屬(Brevundimonas)細菌的主要特征一致。

2.4.3 分子鑒定 菌株A1A18的16S rDNA基因序列長度為1 357 bp，NCBI系統(tǒng)中GenBank登錄號為MK110476。將該序列錄入NCBI，進行Blast比對，結果與短波單胞菌屬(Brevundimonassp.)相應基因序列具有99%的同源性。選取該基因庫中同科近緣的7個屬典型代表菌種進行16S rDNA序列比對，通過MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。通過對系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，可知該菌株為短波單胞菌(Brevundimonassp.)。

2.5 A1A18菌株對土壤中OP的降解能力

2.5.1 土壤中OP加標回收率 毒死蜱、氧化樂果和水胺硫磷3種OP在土壤樣品中的加標回收率見表4?？瞻讓φ罩形礄z測出3種OP殘留。毒死蜱、氧化樂果或水胺硫磷在試驗土樣中的平均加標回收率分別為91.039%～100.703%、 89.215%～99.762%、87.996%～99.702%，相對標準偏差分別為1.906%～4.415%、 1.986%～ 3.830%、2.763%～4.718%。表明使用該方法檢測試驗土壤樣品中的毒死蜱、氧化樂果和水胺硫磷，回收率較高，相對標準偏差較小，符合農(nóng)藥殘留檢測方法對加標回收率70%～110%的要求[18]。

2.5.2 A1A18菌株對土壤中3種有機磷農(nóng)藥的降解能力 試驗土壤中添加降解菌A1A18，對土壤中毒死蜱、氧化樂果和水胺硫磷3種OP的降解均具有促進作用(圖5)。

對添加A1A18菌株處理與未添加降解菌的對照進行比較，隨著試驗時間的增加，土壤中毒死蜱的降解率顯著提高。第3天時，施菌處理和CK的毒死蜱降解率分別為38.75%和21.97%，增幅為76.39%；第5天的降解率分別為63.02%和38.72%，增幅為62.76%。隨后，二者差異呈縮小的趨勢，到第21天，毒死蜱降解率分別為88.81%和76.40%，增幅為16.24%。

表3 菌株A1A18的生理生化試驗結果Table 3 Physiological and biochemical identification results of strain A1A18

注：“+” 表示反應陽性，“-”表示反應陰性。

Note: “+” positive reaction,“-” negative reaction.

圖4 基于A1A18菌株16S rDNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain A1A18 based on 16S rDNA sequence analysis

OP加標質(zhì)量分數(shù)/(mg·kg-1) Mass fractionof OP毒死蜱 Chlorpyrifos平均加標回收率/%Average recovery of standard addition相對標準偏差/%RSD氧化樂果 Folimat平均加標回收率/%Average recovery of standard addition相對標準偏差/%RSD水胺硫磷 Isocarbophos平均加標回收率/%Average recovery of standard addition相對標準偏差/%RSD0.191.0393.01289.2152.74087.9964.7180.594.6421.90698.7092.86190.4593.2911.095.7572.64496.3743.83099.7022.7635.0100.7034.41599.7621.98697.6683.184

在氧化樂果處理組中，添加A1A18菌株與CK的氧化樂果降解率進行比較，二者在前期均表現(xiàn)出較高的降解率，第1天時分別為19.21%和11.98%，增幅為60.38%，第3天的降解率分別為58.29%和42.51%，增幅為37.12%，第7天的降解率分別已達86.19%和76.48%，增幅為12.69%。隨著時間的增加，兩處理的差異逐漸趨于減少，至第14天，二者的降解率均大于 89.62%，且差異均未達顯著水平。至第21天，兩處理的降解率達到94.59%及以上，接近完全降解。

在水胺硫磷處理組中，施菌后顯著提高土壤中農(nóng)藥的降解率。添加A1A18菌株處理的降解率為第1天的11.85%，第7天的51.46%，第21天的87.75%；CK的降解率為第1天的 6.07%，第7天的29.68%，第21天的70.40%。降解率的增幅從95.25%(第1天)逐漸降低至 73.37%(第7天)，進而降低至26.64%(第21天)。

圖5 添加降解菌A1A18對土壤中毒死蜱(A)、氧化樂果(B)和水胺硫磷(C)降解率的影響Fig.5 Effects of strain A1A18 on degradation rate of chlorpyrifos(A),folimat(B) and isocarbophos(C) in tested soil

3 討 論

本試驗所用土壤來自非耕作地，質(zhì)地為砂壤，具有偏堿性、有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)較低、組成成分較簡單，3種OP在該土壤中的平均加標回收率均滿足農(nóng)藥殘留檢測方法的要求，表明該試驗方法的精確度可用于檢測試驗土壤中3種OP的殘留量。

不同的微生物對不同種類OP的降解機制具有差異[19-20]。毒死蜱和水胺硫磷具有P=S雙鍵，氧化樂果具有P=O雙鍵。有的微生物利用有機磷酸水解酶、磷酸三酯酶等催化斷裂磷硫鍵、磷氧鍵和磷氟鍵[19,21]；有的微生物采用共代謝作用、礦化作用、種間協(xié)同代謝作用等降解OP[22]。研究表明，短波單胞菌屬細菌具有磷酸三酯酶[23]，對毒死蜱、樂果和對硫磷等多種OP均具有降解作用[24-26]。分子生物學研究證明，短波單胞菌細胞有關OP的水解酶位于細胞質(zhì)膜的周質(zhì)面，其對有機磷的水解機制涉及雙精氨酸轉運通路[27]。本試驗菌株為短波單胞菌A1A18，對毒死蜱、水胺硫磷和氧化樂果均具有一定的降解能力，由此推測，該菌株對3種OP的降解機制可能與此有關。

除了生物學因素，光照強度、時間，土壤的物理、化學性質(zhì)，以及OP的自身特性均影響其在土壤中的降解率。毒死蜱、氧化樂果和水胺硫磷都有光降解現(xiàn)象[28-30]。土壤質(zhì)地砂壤較粘壤、pH呈堿性較酸性或中性更有利于OP的降解[31]，有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)高有利于OP的吸附[32]。本試驗條件為正常溫室光照，土壤為砂壤、堿性、有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)較低，加之土壤中原有土著微生物對OP具有一定降解作用，因此，土壤試驗對照組中3種OP的降解率都較液體培養(yǎng)試驗更高。尤其氧化樂果，施藥后第14天，無論是否添加降解菌，降解率都高于89.62%，至第21天時，幾乎完全降解。這可能是由于氧化樂果中含有P=O雙鍵，較毒死蜱和水胺硫磷中的P=S雙鍵具有更強的極性，更易發(fā)生斷裂[33]，導致氧化樂果在堿性環(huán)境中較其他2種OP更易降解。

目前，國內(nèi)外對短波單胞菌屬細菌降解OP的研究多涉及單一種類的OP，如Brevundimonassp.Dsp-7對毒死蜱具有一定降解功能[24]；Brevundimonassp.MCM B-427在適宜的pH下對樂果具有較好的降解效果[25]；多株B.diminuta具有對硫磷水解酶，降解能力較強[26]。涉及多種OP底物的該屬降解菌研究較少，如Brevundimonassp.MM1，可以水解苯胺磷、苯胺磷亞砜和苯胺磷砜的P-O-C鍵，對3種OP具有較好的降解能力[34]。采用該屬中的降解菌株用于毒死蜱、氧化樂果和水胺硫磷3種OP污染土壤的修復研究尚未見報道。試驗結果表明，施藥后第7天，添加A1A18菌株處理的土壤中氧化樂果降解率達86.19%，較CK提高12.69%。施藥后第21天，該菌株處理的土壤中毒死蜱和水胺硫磷的降解率均超過87.75%，較CK提高16.24%和24.62%；說明短波單胞菌A1A18菌株促進3種OP的降解，具有較好的田間應用潛力。綜上所述，短波單胞菌屬細菌是具有多種OP降解潛力的微生物，在多種OP底物降解機制和應用開發(fā)等諸方面有待開展進一步研究。

4 結 論

有機磷農(nóng)藥廣譜降解菌短波單胞菌A1A18菌株對毒死蜱、氧化樂果和水胺硫磷具有一定降解能力。在液體培養(yǎng)環(huán)境中，該菌株對3種有機磷農(nóng)藥的降解率分別為45.82%、9.52%和 13.96%。經(jīng)10代培養(yǎng)，確定其農(nóng)藥降解能力具有很好的遺傳穩(wěn)定性。在有機磷原藥質(zhì)量分數(shù)為1.0 mg·kg-1干土的土壤中施用A1A18菌株，降解菌初始數(shù)量密度為0.2×108CFU·g-1干土，施藥后第21天，土壤中毒死蜱和水胺硫磷的降解率分別達到88.81%和87.75%，較CK提高 16.24%和24.62%；施藥后第7天，土壤中氧化樂果降解率達86.19%，較CK提高12.69%。因此，短波單胞菌A1A18作為西北地區(qū)農(nóng)藥污染土壤的修復菌株具有較好的田間應用潛力。