紅花檵木LcCHI基因的克隆、表達(dá)分析及轉(zhuǎn)化研究

榮朵艷，張 翔，虢雅潔，王菊鳳，潘 婷，楊 港，張邦躍

(1.湖南工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖南株洲 412007；2.百合種質(zhì)資源創(chuàng)新與深加工湖南省工程研究中心，湖南株洲 412007；3.生物醫(yī)用納米材料與器件湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南株洲 412007)

紅花檵木(Loropetalumchinensevar.rubrum)為金縷梅科、檵木屬檵木的變種，是具中國特色的觀花觀葉植物，其花、葉中均可合成花青苷物質(zhì)而顯紅色。紅花檵木易于繁殖、耐修剪，同時具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆性，是中國南方很多省園林綠化常用的彩葉植物之一[1]。紅花檵木的紅色葉片具有較高的觀賞價值，但中國南方地區(qū)夏季持續(xù)高溫會導(dǎo)致其葉片顏色由紅變綠，觀賞價值嚴(yán)重降低[2]。目前，對紅花檵木葉色變化的機(jī)制開展了一些研究，高溫會引起紅花檵木葉片花青苷物質(zhì)含量的下降，高溫和強(qiáng)光照或者高溫和高濕度協(xié)同作用的脅迫條件會加快花青苷的消失，而輕度干旱有利于花青苷物質(zhì)的穩(wěn)定[2-5]。然而，對于紅花檵木中花青苷物質(zhì)合成的分子機(jī)制目前還不清楚，花青苷合成途徑基因目前只有LcCHS基因得到克隆[6]。因此，開展紅花檵木花青苷形成分子機(jī)制的研究，對于紅花檵木的葉色育種有重要的意義。

花青苷物質(zhì)是植物產(chǎn)生的一類重要的類黃酮物質(zhì)，其生物合成過程起始于苯丙氨酸途徑，有多種酶類參與催化過程，其中查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase，CHI)直接催化查爾酮形成二氫黃酮，是花青苷物質(zhì)合成途徑的第2個限速酶，對于包括花青苷在內(nèi)的多種類黃酮物質(zhì)的積累都有重要作用。目前，查爾酮異構(gòu)酶基因在許多觀賞植物中已經(jīng)被克隆，包括矮牽牛、彩葉草、紫丁香、紅掌、康乃馨等觀賞植物[7-11]。

為了探究紅花檵木葉片花青苷形成的分子機(jī)制，作者利用轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)和RT-PCR技術(shù)，從紅花檵木中克隆到LcCHI的cDNA序列，獲得基因的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，利用生物信息學(xué)的方法對LcCHI基因編碼的氨基酸同源性以及結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，并采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對該基因在不同組織材料中的表達(dá)進(jìn)行分析。同時構(gòu)建pLcCHI-SUPER1300過表達(dá)載體，并在擬南芥中異源表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植株，這為進(jìn)一步對該基因在紅花檵木花青苷生物合成中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 試材為生長健壯的3 a生紅花檵木扦插苗，于湖南工業(yè)大學(xué)校區(qū)苗圃中栽培。采集植株成熟葉或嫩葉，用液氮速凍， -80 ℃冰箱中保存，備用。于2019年3月下旬取得用于實(shí)時熒光定量PCR分析的不同組織材料(包括根、莖、成熟葉、嫩葉和花)。其中，根為新生的紅色嫩根，莖和嫩葉均為春季新抽材料，成熟葉為2018年秋末抽出的葉片，花取披針形花瓣。擬南芥野生型材料哥倫比亞-0生態(tài)型(Columbia-0，Col-0)種植于營養(yǎng)土(腐殖土∶蛭石∶珍珠巖= 3∶1∶1)中，置于光照培養(yǎng)箱中生長，生長條件為：16 h光照，8 h黑暗，濕度為70%。

1.1.2 主要試劑 多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒購于北京艾德萊生物科技有限公司。Super M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase Inhibitor、DH5α感受態(tài)、質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、PCR MIX、限制性內(nèi)切酶等購于生工生物工程上海有限公司。PrimeSTAR GXL高保真DNA聚合酶購于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。FastStart Essential DNA Green Master試劑購自羅氏應(yīng)用科學(xué)部。無縫連接試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司。農(nóng)桿菌AGL0和過表達(dá)質(zhì)粒pSUPER1300為生物醫(yī)用納米材料與器件湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。引物合成及測序工作均由華大基因完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第1鏈的合成 使用RNA提取試劑盒，提取紅花檵木葉片的RNA，并用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。利用Super M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA第1鏈，反應(yīng)體系為20.0 μL：先加入8.0 μL RNA和1.0 μL Oligo (dT)18引物，再加入4.0 μL 5×RT 緩沖液、4.0 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)、0.5 μL RNase Inhibitor和1.0 μL Super M-MuLV，最后用DEPC處理水加至20.0 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃ 50 min，65 ℃ 15 min，產(chǎn)物用于進(jìn)一步的PCR擴(kuò)增。

1.2.2 紅花檵木LcCHI基因的克隆 利用已經(jīng)完成的紅花檵木轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，從中篩選到1個CHI同源基因。經(jīng)分析紅花檵木LcCHI的cDNA序列中包含有完整的開放閱讀框ORF，設(shè)計ORF上、下游區(qū)域特異引物CHI-LP和CHI-RP(表1)，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為25.0 μL：2×PCR MIX 12.5 μL，上、下游引物各0.7 μL，cDNA 模板0.3 μL，ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)反應(yīng)； 72 ℃ 2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測正確后直接送測序(測序引物為CHI-LP和CHI-RP)，以確定CHI的cDNA序列及編碼框序列。

1.2.3 紅花檵木LcCHI氨基酸同源性分析及功能預(yù)測 使用DNAMAN 6.0軟件對LcCHI的cDNA序列進(jìn)行分析，預(yù)測該基因編碼的氨基酸序列；利用NCBI網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的BLASTP對該基因編碼的氨基酸同源序列進(jìn)行搜索，并下載同源性氨基酸序列。利用DNAMAN 6.0軟件對氨基酸序列進(jìn)行多重比對，利用MEGA 6軟件和非加權(quán)組平均法(UPGMA)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用NCBI網(wǎng)站的在線軟件CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對LcCHI基因編碼氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；利用在線軟件SWISS-MODEL(https://swissmodel. expasy.org/)對LcCHI蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.2.5 紅花檵木LcCHI過表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化擬南芥 根據(jù)LcCHI的cDNA片段測序結(jié)果，確定了LcCHI基因的ORF完整序列。利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計能夠擴(kuò)增出紅花檵木LcCHI基因的ORF引物CHI-ATG和CHI-TAG，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為25.0 μL：5×GXL buffer 5.0 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol each) 2.0 μL，上、下游引物各0.7 μL，cDNA模板0.3 μL，PrimeSTAR GXL DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 1 min，共35個循環(huán)反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物膠回收后用無縫克隆酶連接到過表達(dá)載體pSUPER1300上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，陽性菌經(jīng)PCR鑒定后送測序鑒定。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

注：小寫堿基為表達(dá)載體末端同源序列，用于構(gòu)建重組載體；大寫堿基為基因特異引物序列。

Note:Lower-case indicates bases homologous to vector ends in order to make the recombinant vector；upper-case means gene specific primers.

提取大腸桿菌陽性菌的pLcCHI-SUPER1300重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)AGL0中，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥。轉(zhuǎn)基因種子在潮霉素質(zhì)量濃度為25 mg/L的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，陽性苗轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)土中繼續(xù)生長。待轉(zhuǎn)基因植株生長5周后剪取蓮座葉，分別用TRIzon法和SDS法提取葉片的RNA和DNA，RNA進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄成第1鏈cDNA。分別以轉(zhuǎn)基因植株的cDNA和DNA為模板，用ORF特異引物CHI-ATG和CHI-TAG進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽性苗的鑒定。半定量RT-PCR檢測LcCHI基因的表達(dá)時選擇AtACTIN8為擬南芥的內(nèi)參基因(引物序列見表1)。

2 結(jié)果和分析

2.1 紅花檵木LcCHI基因cDNA序列的克隆

利用紅花檵木葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，從中篩選出1個查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase，CHI)同源基因，命名為LcCHI。對LcCHI序列片段進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列片段包含完整的ORF序列。從紅花檵木成熟葉片中提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量(圖1-A)，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成第1鏈cDNA。設(shè)計CHI-LP和CHI-RP引物，以cDNA為模板，擴(kuò)增出約800 bp的cDNA片段(圖1-B)，該片段包含LcCHI完整ORF序列，PCR產(chǎn)物直接送測序，確定LcCHI的ORF序列。結(jié)果表明，紅花檵木LcCHI基因的ORF總長度為657 bp，編碼218個氨基酸殘基(圖2)。

2.2 紅花檵木LcCHI基因編碼的氨基酸序列分析

2.2.1LcCHI多重比對及保守結(jié)構(gòu)域 利用DNAMAN 6.0軟件，對紅花檵木LcCHI和來源于玫瑰RrCHI(AKT71851.1)、月季RcCHI(XP_024176829.1)、茶樹CsCHI(ASU87415.1)、美洲葡萄VlCHI(ACS36662.1)和櫻桃李PcCHI(AKV89240.1)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，紅花檵木LcCHI與其他植物CHI氨基酸序列高度保守，氨基酸一致性均超過75%(圖3)。通過與擬南芥AtCHI和紫花苜蓿MsCHI氨基酸序列中催化位點(diǎn)的比對分析[12-13]，發(fā)現(xiàn)5個氨基酸殘基Arg(38)、Thr(46)、Tyr(108)、Asn(115)和Ser(192)執(zhí)行LcCHI酶的催化活性(圖3)。利用NCBI的在線軟件CD-Search對紅花檵木LcCHI進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明紅花檵木LcCHI屬于查爾酮_3超家族成員，編碼典型的查爾酮-黃烷酮異構(gòu)酶(圖4)。

A.總RNA Total RNA；B.CHI-LP和CHI-RP擴(kuò)增的cDNA片段 cDNA sequence amplificated by using CHI-LP and CHI-RP primer pairs

圖1LcCHI的cDNA序列擴(kuò)增
Fig.1 Sequence amplification ofLcCHIgene

粗體下劃線分別表示起始密碼子和終止密碼子 Underline in bold indicates initial codon and stop codon respectively

圖2LcCHI的核苷酸及其氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide and amino acid sequences ofLcCHIgene

★.酶催化殘基 Enzyme catalytic residues；Lc.紅花檵木Loropetalumchinensevar.rubrum；Rr.玫瑰Rosarugosa；Rc.月季Rosachinensis；Cs.茶樹Camelliasinensis；Vl.美洲葡萄Vitislabrusca；Pc.櫻桃李Prunuscerasifera

圖3 LcCHI多重比對分析
Fig.3 Multiple alignment analysis of LcCHI

圖4 LcCHI保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Conserved domain analysis of LcCHI

2.2.2 LcCHI系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 為更加明確紅花檵木LcCHI氨基酸序列與其他植物中CHI氨基酸序列的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 6軟件對來源于紅花檵木LcCHI、玫瑰RrCHI、月季RcCHI、茶樹CsCHI、美洲葡萄VlCHI、櫻桃李PcCHI、橄欖CaCHI(AEO36936.1)、龍眼DlCHI(AEO36980.1)、美洲葡萄VlCHI(ACS36662.1)、牡丹PsCHI(AEK70330.1)、芍藥PlCHI(AEK32592.1)、煙草NtCHI(NP_001312216.1)、矮牽牛PhCHI(CAA32730.1)、擬南芥AtCHI(CAB94991.1)、水稻OsCHI(AAM13448.1)和玉米ZmCHI(NP_001144002.2)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。結(jié)果如圖5所示，紅花檵木LcCHI氨基酸序列與玫瑰、月季和櫻桃李等木本植物的親緣性較近，而與煙草、擬南芥、水稻等草本植物的親緣性較遠(yuǎn)。

Rr.玫瑰Rosarugosa；Rc.月季Rosachinensis；Pc.櫻桃李Prunuscerasifera；Lc.紅花檵木Loropetalumchinensevar.rubrum；Ca.橄欖Canariumalbum；Dl.龍眼Dimocarpuslongan；Cs.茶樹Camelliasinensis；Ps.牡丹Paeoniasuffruticosa；Pl.芍藥Paeonialactiflora；Vl.美洲葡萄Vitislabrusca；Nt.煙草Nicotianatabacum；Ph.矮牽牛Petuniaxhybrida；At.擬南芥Arabidopsisthaliana；Os.水稻OryzasativaJaponica Group；Zm.玉米Zeamays

圖5 LcCHI系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
Fig.5 Phylogenetic tree analysis of LcCHI

圖6 LcCHI蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Tertiary structure prediction of LcCHI protein

2.3 LcCHI基因在不同組織中的表達(dá)分析

對LcCHI基因在紅花檵木不同組織的表達(dá)分析結(jié)果表明(圖7)，LcCHI在根、莖、花、成熟葉和嫩葉中均有表達(dá)，但表達(dá)存在一定的差異性。其中根中表達(dá)量最高，嫩葉、莖、花中的表達(dá)量次之，成熟葉最低，為根中表達(dá)量的1/4。

圖7 不同組織中LcCHI基因的表達(dá)分析Fig.7 Relative expression of LcCHI gene in different tissues

2.4 LcCHI過表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化擬南芥

根據(jù)LcCHI基因的cDNA序列，設(shè)計特異引物CHI-ATG和CHI-TAG(表1，上、下游引物均包含約16 bp的載體片段)，用高保真酶GXL擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳正確后膠回收，目的產(chǎn)物連接到已線性化的表達(dá)載體上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，PCR擴(kuò)增及XbaⅠ+PstⅠ質(zhì)粒雙酶切鑒定正確后送測序，確定過表達(dá)載體pLcCHI-SUPER1300構(gòu)建成功(圖8)。提取pLcCHI-SUPER1300質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)AGL0中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥。提取T1代轉(zhuǎn)基因植株的DNA，PCR擴(kuò)增LcCHI基因，在9個T1代植株中檢測到7個陽性苗，確定T-DNA整合到擬南芥基因組中(圖9-A)。以轉(zhuǎn)基因植株的cDNA為模板、CHI-ATG和CHI-TAG為引物進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增，擬南芥AtACTIN8基因?yàn)閮?nèi)參基因(引物序列見表1)，結(jié)果顯示受檢測的4個T1代轉(zhuǎn)基因株系中有LcCHI的表達(dá)，而野生型Col-0沒有檢測到LcCHI基因的表達(dá)(圖9-B)，表明紅花檵木LcCHI基因在擬南芥中異源表達(dá)。在正常的生長條件下，轉(zhuǎn)基因LcCHI的T1代植株并沒有表現(xiàn)出明顯的生長表型。

A.pLcCHI-SUPER1300載體示意圖 Schematic diagram ofpLcCHI-SUPER1300；B.pLcCHI-SUPER1300的大腸桿菌PCR鑒定，Pos為質(zhì)粒陽性對照，Ng為陰性對照，帶1～4為大腸桿菌單克隆 PCR identification ofpLcCHI-SUPER1300 transferredEscherichiacoli, Pos is positive control of plasmid, Ng is negative control, bands 1 to 4 are clones ofEscherichiacoli；C.pLcCHI-SUPER1300質(zhì)粒雙酶切 Double digests ofpLcCHI-SUPER1300 plasmid

圖8LcCHI過表達(dá)載體的構(gòu)建
Fig.8 Construction ofLcCHIoverexpression vector

A.轉(zhuǎn)基因株系DNA的PCR擴(kuò)增，帶1～9為T1代轉(zhuǎn)基因植株，Pos為質(zhì)粒陽性對照 PCR amplification of transgenic lines, bands 1 to 9 are transgenic plants, Pos is positive control of plasmid；B.轉(zhuǎn)基因株系的半定量RT-PCR擴(kuò)增，Col-0為陰性對照，帶1～4為轉(zhuǎn)基因株系，LcCHI和AtACTIN8基因擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為26個 Semi-quantitative RT-PCR amplification of transgenic lines forLcCHIandAtACTIN8with 26 cycles, Col-0 is negative control, bands 1-4 are transgenic lines

圖9LcCHI轉(zhuǎn)基因株系鑒定
Fig.9 Identification ofLcCHItransgenic lines

3 討 論

花青苷是植物類黃酮次生代謝物質(zhì)的一個分支途徑，其在植物器官中的含量及種類與相應(yīng)的器官顏色緊密相關(guān)[14]。植物花青苷的生物合成途徑酶類已經(jīng)得到深入的了解，其中前期關(guān)鍵合成酶類有查爾酮合成酶(Chalcone synthesis，CHS)、查爾酮異構(gòu)酶CHI和黃烷酮-3-羥化酶(Flavanone-3-hydroxylase，F(xiàn)3H)，后期關(guān)鍵酶主要有二氫黃酮醇-4-還原酶(Dihydroflavonol-4-reductase，DFR)、花青素合成酶(Anthocyanidin synthase，ANS)和UDPG-類黃酮葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(UDPG-flavonoid glucosyltransferase，UFGT)，這些酶類活性的改變都可能引起相應(yīng)器官中花青苷含量及顏色的變化[14-15]。

CHI是花青苷生物合成途徑的第二個關(guān)鍵酶類，也是影響包括花青苷物質(zhì)在內(nèi)的多種類黃酮物質(zhì)合成的限速酶。利用CHI酶活性缺失的材料，確定CHI基因在多種觀賞植物花青苷生物合成過程中起重要作用。Miyahara等[11]的研究表明，康乃馨的一個CHI基因(Dca60979)的高表達(dá)與紅色花的生成緊密相關(guān)，Dca60979基因轉(zhuǎn)錄提前終止導(dǎo)致花瓣積累查爾酮而形成橘黃色花。對翠菊和仙來客的黃色花形成機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，黃色花品種中查爾酮異構(gòu)酶CHI的活性缺失，花青苷合成途徑被阻斷，花朵中積累查爾酮物質(zhì)而顯黃色[16-17]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，研究人員也對CHI基因的功能進(jìn)行分析。Nishihara等[18]利用RNAi技術(shù)對煙草中NtCHI基因功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NtCHI表達(dá)的下調(diào)會引起花朵內(nèi)包括花青苷在內(nèi)的總黃酮物質(zhì)含量的降低，同時花色變淺。將牡丹的PsCHI1基因轉(zhuǎn)入煙草中，轉(zhuǎn)基因材料中總黃酮醇和黃酮物質(zhì)含量提升兩倍，但是花瓣中花青苷物質(zhì)的含量降低、花瓣顏色變淡[19]。在番茄中異源表達(dá)矮牽牛的PhCHI-A基因，轉(zhuǎn)基因番茄的果皮和果肉中黃酮醇物質(zhì)含量分別比對照材料增加78倍和21倍，提高了果實(shí)的營養(yǎng)價值[7]。在煙草中異源表達(dá)水母雪蓮的SmCHI基因也可以提高總黃酮物質(zhì)的含量[20]。在黃芩毛狀根中過表達(dá)SbCHI合成酶基因可提高多種類黃酮物質(zhì)含量，而抑制毛狀根中SbCHI基因的表達(dá)會降低類黃酮物質(zhì)產(chǎn)量[21]。因此，植物中CHI酶活性對于花青苷物質(zhì)的合成是必須的，CHI酶活性的缺失或降低可用于培育淡顏色花卉品種；而CHI酶活性的增強(qiáng)除用于培育不同顏色的觀賞植物新品種外，也可用于培育總黃酮類含量高的植物品種，提升其藥用或食用價值。

本研究還克隆了紅花檵木LcCHI基因的ORF，并構(gòu)建pLcCHI-SUPER1300過表達(dá)載體，在擬南芥中異源表達(dá)該基因并獲得轉(zhuǎn)基因植株。正常生長條件下，在多個LcCHI過表達(dá)T1代株系中并沒有觀察到明顯的生長表型，也沒有引起花青苷含量的累積，可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因株系中合成其他的類黃酮物質(zhì)(如黃酮醇、異黃酮、原花色素等)。LcCHI的過量表達(dá)對擬南芥中類黃酮物質(zhì)積累的影響還需要進(jìn)一步分析。在后面的研究中，將利用高效液相色譜[16]和DMACA法[22]對擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的黃酮醇、原花色素等類黃酮物質(zhì)的累積進(jìn)行分析，以獲得LcCHI基因的生理學(xué)功能。為了確定LcCHI在紅花檵木中的生物學(xué)功能，以后在建立起紅花檵木遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上，將利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除該基因[23]，從而進(jìn)一步了解該基因在紅花檵木生長發(fā)育及花青苷合成中的作用。