油茶樹(shù)根際土壤解有機(jī)磷細(xì)菌的分離、鑒定及解磷能力分析

陳定安 魏小武 張敏

摘 要：為了獲得高效解有機(jī)磷細(xì)菌，從油茶植株根際土壤中分離到21株解有機(jī)磷細(xì)菌，采用透明圈法進(jìn)行復(fù)篩，僅有4株細(xì)菌能在有機(jī)磷培養(yǎng)基上形成明顯的透明圈。4株細(xì)菌的D/d值在1.62～2.71之間，其中菌株Y6的D/d值最大，為2.71;發(fā)酵上清液有效磷含量為8.50～14.79 mg/L，較CK增加7.88～14.17 mg/L，其中菌株Y6發(fā)酵上清液有效磷含量最多，為 14.79 mg/L，較CK增加14.17 mg/L。根據(jù)菌株Y6的菌落形態(tài)特征和生理生化特征及16S rDNA序列分析結(jié)果，初步確定菌株Y6為假單胞菌屬。該菌株有利于改善油茶磷素供應(yīng)，促進(jìn)油茶生長(zhǎng)，在生物有機(jī)肥研制中具有較大潛力。

關(guān)鍵詞：解有機(jī)磷細(xì)菌;假單胞菌;有效磷;油茶

中圖分類(lèi)號(hào)：S154.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-060X（2019）10-0008-04

Abstract： In order to obtain high-efficiency organophosphate-dissolving bacteria， 21 strains of organophosphate-dissolving bacteria were isolated from the tea-oil rhizosphere soil， and the transparent circle method was used for rescreening. Only 4 bacteria could form obvious transparent circles on the organic phosphorus medium. The D/d values of the four bacteria ranged from 1.62 to 2.71， and the strain Y6 had the largest D/d value of 2.71. The effective phosphorus content of the fermentation supernatant was 8.50-14.79 mg/L， which was 7.88-14.17 mg/L higher than that of CK. The strain Y6 had the highest soluble phosphorus content of 14.79mg/L in the fermentation supernatant， which was 14.17mg/L higher than CK. According to 16S rDNA sequence analysis， morphological， physiological and biochemical characteristics， strain Y6 was initially identified as Pseudomonas. Strain Y6 is beneficial to improving the supply of phosphorus in tea-oil rhizosphere soil and promoting the growth of tea-oil tree. It has great potential in the development of bio-organic fertilizer.

Key words： organophosphate-dissolving bacteria; Pseudomonas; effective phosphorus; tea-oil tree

磷是植物生長(zhǎng)所需的主要營(yíng)養(yǎng)元素之一。農(nóng)田土壤中全磷的含量高，但是有效磷的含量卻很低。這是因?yàn)橥寥乐械牧字饕且噪y溶性的化合物存在，絕大部分不能被植物直接吸收利用。我國(guó)有74%的耕地土壤存在缺磷現(xiàn)象[1]，有機(jī)態(tài)磷約占土壤全磷量的20%～50%[2]。通常采用施用化學(xué)磷肥的方式提供植物所需的磷元素，但是化學(xué)磷肥利用率很低，通常只有 5%～25%[3]。解磷菌能將難溶性或不溶性磷轉(zhuǎn)化為植物可利用的形態(tài)，提高土壤中磷元素的利用率。林啟美等[4]通過(guò)對(duì)農(nóng)田、草坪、林地和菜地根際土壤溶磷微生物數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)的研究，發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷細(xì)菌主要為芽孢桿菌屬，其次是假單胞菌屬。

油茶是我國(guó)所特有的世界4大木本油料樹(shù)種之一[5]。截至2018年末，湖南省油茶林總面積達(dá)到140.74萬(wàn)hm2，茶油總產(chǎn)量26.2萬(wàn)t，產(chǎn)值450億元，居全國(guó)首位[6]。茶籽油中含有單不飽和脂肪酸——油酸，能夠降低血液中膽固醇和低密度脂蛋白的濃度，預(yù)防心血管疾病的發(fā)生[7]。研究表明，油茶根際土壤中存在溶磷菌，可以改良土壤理化性質(zhì)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加作物產(chǎn)量，對(duì)生態(tài)環(huán)境友好[8]。

課題組從健康的油茶植株根際土壤采樣，分離獲得一批可分解有機(jī)磷的菌株，從中篩選出一株高效解有機(jī)磷細(xì)菌，對(duì)其解磷能力進(jìn)行了分析，通過(guò)菌落形態(tài)特征和生理生化特征以及16S rDNA序列分析，初步確定菌株的分類(lèi)地位，為微生物肥料的研制提供理論依據(jù)，進(jìn)而達(dá)到減少化肥施用量、提高產(chǎn)品質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 采集邵陽(yáng)市油茶林健康的油茶植株根際土壤，置于陰涼處自然風(fēng)干后于4℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）有機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，卵磷脂 0.2 g，CaCO3 5.0 g，酵母膏 0.4 g，瓊脂 20 g，dd H2O 1 000?mL，pH值7.0～7.5。（2）LB培養(yǎng)基參見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。

2.6 解有機(jī)磷細(xì)菌Y6的生長(zhǎng)曲線

微生物的生長(zhǎng)曲線，可以分為延緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個(gè)階段。從圖4可以看出，在LB液體培養(yǎng)基中，菌株Y6的延緩期在4 h以?xún)?nèi)，4 h后OD600值迅速增加，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，22 h后OD600值達(dá)到最大，為5.21，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，并保持相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間。

3 結(jié)論與討論

目前，解有機(jī)磷細(xì)菌的分離，主要以卵磷脂作為單一的有機(jī)磷來(lái)源，解有機(jī)磷細(xì)菌分泌的磷酸酶將卵磷脂分解為膽堿、甘油、脂肪酸、磷酸，膽堿被進(jìn)一步分解為胺、有機(jī)酸、二氧化碳、醇，最終在有機(jī)磷培養(yǎng)基上形成透明圈[11]。課題組從健康的油茶植株根際土壤采樣，共分離到21株在有機(jī)磷培養(yǎng)基上有透明圈的菌株，采用溶磷圈法進(jìn)行復(fù)篩，僅有4株細(xì)菌能在有機(jī)磷培養(yǎng)基上形成明顯的透明圈，其余17株菌沒(méi)有透明圈，失去解磷現(xiàn)象。Venkateswarlu 等[12]也報(bào)道過(guò)大多數(shù)解磷細(xì)菌經(jīng)過(guò)幾次傳代培養(yǎng)后，會(huì)失去解磷能力。

30℃恒溫箱中培養(yǎng)4 d，4株細(xì)菌的D/d值在1.62～2.71之間，其中菌株Y6的透明圈直徑（D）為24.9 mm，菌圈直徑（d）為9.2 mm，D/d值最大，為2.71。D/d比值的大小只是說(shuō)明細(xì)菌具有解磷能力，不能判定細(xì)菌解磷能力的大小，很多學(xué)者有類(lèi)似的觀點(diǎn)[13-14]。

4株細(xì)菌在30℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)4 d后，發(fā)酵上清液有效磷含量為8.50～14.79 mg/L，CK上清液有效磷含量為0.62 mg/L，上清液有效磷增加量為7.88～14.17 mg/L，其中菌株Y6發(fā)酵上清液有效磷含量最高，為 14.79 mg/L，較CK增加14.17 mg/L。4株細(xì)菌的D/d值從大至小排列依次為Y6>Y12>Y11>Y3，而4株細(xì)菌發(fā)酵上清液有效磷含量由高到低排列依次為Y6>Y3>Y12>Y11，表明解磷細(xì)菌D/d 值和發(fā)酵上清液有效磷含量之間并不總是呈正相關(guān)，這與伍善東等[15]的研究結(jié)果一致。

菌株Y6的發(fā)酵液pH值隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加逐步降低，培養(yǎng)144 h后發(fā)酵液pH值穩(wěn)定在6.01。發(fā)酵上清液有效磷含量先升高后降低，培養(yǎng)108 h后發(fā)酵上清液有效磷含量達(dá)最大值，為17.11 mg/L，說(shuō)明菌株Y6發(fā)酵液pH值的變化不是其解有機(jī)磷的必要條件。趙小蓉等[16]的研究表明，發(fā)酵液有效磷含量與培養(yǎng)液pH值存在一定的相關(guān)性，但是培養(yǎng)液pH的下降，并不是解磷的必要條件，對(duì)此，很多學(xué)者也發(fā)現(xiàn)二者的相關(guān)性較為微弱[17-18]。發(fā)酵培養(yǎng)液pH值的下降與解磷菌分泌有機(jī)酸有關(guān)，H+還有其他來(lái)源，如NH4+/H+交換機(jī)制和呼吸作用。目前，認(rèn)為解有機(jī)磷細(xì)菌分泌磷酸酶是主要的解磷機(jī)理之一，張淑紅[19]認(rèn)為解有機(jī)磷細(xì)菌分泌的有機(jī)酸、蛋白質(zhì)和多糖可能也具有一定的溶磷效果。

根據(jù)菌株Y6的菌落形態(tài)特征和生理生化特征及16S rDNA序列分析結(jié)果，初步確定菌株Y6為假單胞菌屬。

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（責(zé)任編輯：成 平）