白菜根腫病生防菌的篩選及防治效果評(píng)價(jià)

劉振香　顧志光　徐文鳳　孟祥坤　胡兆平　胡紅濤

摘要：從山東省臨沂市蘭陵縣、山東省壽光市、河南省商丘市夏邑縣多年種植白菜且根腫病爆發(fā)嚴(yán)重地塊采集正常白菜植株根際周圍土樣，對(duì)其進(jìn)行生防菌分離篩選及防治白菜根腫病效果評(píng)價(jià)，以期獲得高效拮抗白菜根腫病菌的生防菌。通過(guò)梯度平板稀釋法對(duì)采集土樣進(jìn)行生防菌分離，以黃瓜立枯病菌和香蕉枯萎病菌為指示菌對(duì)生防菌進(jìn)行初步篩選，利用根腫病孢子裂解試驗(yàn)進(jìn)一步篩選，通過(guò)盆栽試驗(yàn)評(píng)價(jià)生防菌株防治根腫病的效果。結(jié)果表明，放線菌株KA-35對(duì)白菜根腫病的防治效果為57.11%，單株地上部鮮重增加127.40%。該研究篩選出了對(duì)白菜根腫病有良好生防效果的菌株，為生防菌的進(jìn)一步研究工作奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：白菜;根腫病;生防菌;防治效果

中圖分類號(hào)：S436.349文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）10-0130-05

Screening and Evaluation of Biocontrol Bacteria

against Plasmodiophora brassicae

Liu Zhenxiang1，Gu Zhiguang1，2，Xu Wenfeng1，2，3，

Meng Xiangkun1，2，Hu Zhaoping1，2，3，Hu Hongtao1，2，3

（1.Kingenta Ecological Engineering Group Co.， Ltd.， Linyi 276700， China;

2.State Key Labortory of Nutrition Resources Integrated Utilization， Linyi 276700， China;

3. Key Laboratory of Plant Nutrition and New Fertilizer R&D， Ministry of Agriculture， Linyi 276700， China）

Abstract Soil samples around the rhizosphere of normal Chinese cabbage plants were collected from Lanling County of Linyi City and Shouguang City in Shandong Province and Xiayi County of Shangqiu City in Henan Province， where the outbreak of Clubroot disease was serious for many years. The isolation and screening of biocontrol bacteria and the evaluation on the control effect were carried out in order to obtain biocontrol bacteria with high efficiency against Clubroot disease of Chinese cabbage. The gradient plate dilution method was used to isolate biocontrol bacteria from soil samples. The biocontrol bacteria were preliminarily screened out by plate confrontation test with Cucumber Rhizoctonia solani and Banana Fusarium wilt as indicator bacteria. The spore lysis test of Clubroot disease was conducted for further screening. Finally， the effect of biocontrol bacteria screened out by pot experiment was evaluated. The results showed that the control effect of actinomycete KA-35 on Clubroot disease was 57.22% in pot experiment， and the aboveground fresh weight per plant increased by 127.40%. The strains with better biocontrol effects against Chinese cabbage Clubroot disease were screened out， which laid a foundation for further research.

Keywords Chinese cabbage;Clubroot disease;Biocontrol bacteria;Control efficiency

根腫病又稱根癌病，是目前危害十字花科作物最嚴(yán)重的世界性土傳病害，由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woronin） 侵染引起，寄主范圍廣，可危害白菜、甘藍(lán)、蘿卜、薺菜、花椰菜和油菜等 100 多種栽培和野生十字花科植物[1]，在整個(gè)生育期均可發(fā)生，以苗期為主。病菌侵染后導(dǎo)致根部薄壁細(xì)胞增生形成腫根，腫根多發(fā)生在主根和側(cè)根，初期表面光滑，后期表面龜裂、粗糙，阻礙根系吸收水分和營(yíng)養(yǎng)。發(fā)病初期病株地上部癥狀不明顯，當(dāng)病害發(fā)展到一定程度時(shí)，葉片早晨尚好，中午萎蔫，嚴(yán)重時(shí)植株枯死，平均產(chǎn)量損失達(dá)20%～30%，嚴(yán)重的高達(dá)60%以上乃至失收[2， 3]。蕓薹根腫菌具有嚴(yán)格的專性寄生范圍，其休眠孢子在土壤中的存活能力很強(qiáng)，研究表明，休眠孢子在土壤中15～20年仍能萌發(fā)，并且具備致病能力，土壤一旦污染，將不再適宜種植十字花科植物[4， 5]。

根腫病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[16]：0級(jí)，根部無(wú)腫瘤;1級(jí)，側(cè)根有小腫瘤;3級(jí)，主根腫大，直徑小于2倍莖基部;5級(jí)，主根腫大，直徑是莖基部的 2～3倍;7級(jí)，主根腫大，直徑是莖基部的3～4倍;9級(jí)，主根腫大，直徑是莖基部的4倍以上或腫瘤龜裂。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)發(fā)病株數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)發(fā)病值）×100;

防治效果（%）=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌的篩選

從15份土壤樣品中共分離出421株菌，其中細(xì)菌255株、放線菌101株、真菌65株。共篩選出18株對(duì)黃瓜立枯病菌和香蕉枯萎病菌均有較強(qiáng)抑制作用的生防菌，包括細(xì)菌（KB）11株、放線菌（KA）5株、真菌（KF）2株，抑菌效果見(jiàn)表1。其中放線菌KA-35對(duì)兩種病原菌均有很強(qiáng)的抑制作用，抑菌率分別是78.67%和63.83%;細(xì)菌KB-94對(duì)黃瓜立枯病菌有很強(qiáng)的抑制作用（79.33%）;放線菌KA-3對(duì)香蕉枯萎病菌有很強(qiáng)的抑制作用（63.00%）。

2.2 生防菌對(duì)根腫病菌孢子的裂解率

18株生防菌中有8個(gè)生防菌代謝產(chǎn)物上清液對(duì)根腫病菌孢子的裂解率在30%以上（表2），其中放線菌株KA-35、KA-29和細(xì)菌菌株KB-244代謝產(chǎn)物上清液對(duì)根腫病菌孢子的裂解率分別達(dá)45.26%、42.11%和48.42%。

2.3 溫室盆栽防治效果評(píng)價(jià)

選用對(duì)根腫病菌孢子裂解效果較好的KA-35、KA-29和KB-244菌株，通過(guò)沖施四季小白菜檢測(cè)對(duì)根腫病的防治效果。結(jié)果（表3）表明，三個(gè)菌株均對(duì)根腫病有防治效果，其中放線菌株KA-35防效最好，為57.11%，單株地上部鮮重增加127.40%;細(xì)菌KB-244防效次之，為39.61%，單株地上部鮮重增加33.41%。

3 討論與結(jié)論

本研究從土壤中篩選出了11株細(xì)菌、5株放線菌、2株真菌共18株對(duì)黃瓜立枯病菌和香蕉枯萎病菌都有較強(qiáng)抑制作用的生防菌，通過(guò)根腫病孢子裂解試驗(yàn)從中篩選出KA-35、KA-29和KB-244 3株生防菌用于盆栽試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)KA-35和KB-244能有效抑制白菜根腫病的爆發(fā)，且單株地上部鮮重較對(duì)照顯著增加。多數(shù)生防菌在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)有較好防效，在田間應(yīng)用時(shí)卻不甚理想，主要原因是生防菌在農(nóng)作物上難以定殖[17]。雖然KA-35和KB-244均來(lái)源于白菜根系，且在盆栽試驗(yàn)中能有效抑制根腫病的爆發(fā)，但其在大田中的效果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

蔣歡等[18]發(fā)現(xiàn)土壤pH 4.50～6.50的弱酸性環(huán)境利于根腫病的發(fā)生，通過(guò)調(diào)節(jié)土壤pH值可以有效防治根腫病的發(fā)生。楊亨等[19]對(duì)綿陽(yáng)28個(gè)油菜主栽品種進(jìn)行抗根腫病鑒定及聚類分析，發(fā)現(xiàn)不同品種對(duì)根腫病的抗性不同，通過(guò)選育抗性品種可以降低根腫病的發(fā)病情況?？赏ㄟ^(guò)栽培前施用石灰、硅鈣鉀鎂肥等調(diào)節(jié)土壤pH為中性或偏堿性，再結(jié)合栽培抗根腫病品種，移栽后沖施KA-35、KB-244、XF-1等生防菌株綜合防治根腫病的發(fā)生。

放線菌能產(chǎn)生豐富的、活性多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，與人類生產(chǎn)、生活有著極為密切的關(guān)系，其天然代謝產(chǎn)物一直是現(xiàn)代醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)中藥物先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源，如阿維菌素、鏈霉素、寧南霉素、多抗霉素等，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有很重要的地位。應(yīng)用其代謝產(chǎn)物防治植物病害，可減少農(nóng)藥用量，維系生態(tài)平衡，確保農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[20， 21]。本研究篩選出的放線菌株KA-35不僅能抑制白菜根腫病的爆發(fā)，而且對(duì)黃瓜立枯病菌和香蕉枯萎病菌都有很好的抑制效果，后期將通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化、提純對(duì)其代謝產(chǎn)物做進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]Donald C， Porter I，Dixon G R. Integrated control of clubroot[J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2009， 28（3）：289-303.

[2]Devos S， Vissenberg K， Verbelen J P， et al. Infection of Chinese cabbage by Plasmodiophora brassicae leads to a stimulation of plant growth： impacts on cell wall metabolism and hormone balance[J]. New Phytologist， 2005， 166： 241-250.

[3]Howard R J，Strelkov S E， Harding M W. Clubroot of cruciferous crops-new perspectives on an old disease[J]. Canadian Journal of Plant Pathology， 2010， 32（1）： 43-57.

[4]劉獨(dú)臣， 冉茂林， 汪小川， 等. 葉芥苗期根腫病綜合防治技術(shù)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 43（16）： 77-79.

[5]劉郵洲， 杜艷， 喬俊卿， 等. 甘藍(lán)根腫病生防細(xì)菌的篩選、鑒定及評(píng)價(jià)[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 37（4）： 83-90.

[6]孫良菲， 任佐華， 彭沙莎， 等. 白菜根腫病菌拮抗微生物的篩選及防治效果評(píng)價(jià)[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013（1）：84-87.

[7]Lahlali R， McGregor L， Song T， et al. Heteroconium chaetospira induces resistance to clubroot via upregulation of host genes involved in jasmonic acid， ethylene， and auxin biosynthesis[J]. PLoS ONE， 2014， 9（4）： e94144.

[8]Fu L， Li H， Wei L， et al. Antifungal and biocontrol evaluation of four lysobacter strains against clubroot disease[J]. Indian Journal of Microbiology， 2018， 58（3）： 353-359.

[9]周青， 王笑， 蘇婷， 等. 青枯病和根腫病生防細(xì)菌BS2004的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)， 2012， 28（4）： 537-544.

[10]Guo S， Mao Z ， Wu Y ， et al. Genome sequencing of Bacillus subtilis strain XF-1 with high efficiency in the suppression of Plasmodiophora brassicae[J]. Genome Announcements， 2013， 1（2）： e00066-13.

[11]中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所. 土壤理化分析[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1978.

[12]陳天壽. 微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 1995.

[13]王會(huì)軍， 陳卓君， 吳毅歆， 等. 防治十字花科作物根腫病的油菜內(nèi)生細(xì)菌分離與鑒定[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)， 2014， 36（1）： 92-97.

[14]司軍， 李成瓊， 肖崇剛， 等. 甘藍(lán)根腫病接種方法的研究[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2003， 25（3）： 216-219.

[15]謝晶. 植物病原菌拮抗微生物的篩選、鑒定及拮抗機(jī)理研究[D]. 成都：四川大學(xué)， 2004.

[16]吳道軍， 陳國(guó)康， 楊曉琴， 等. 4種甘藍(lán)根腫病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用評(píng)價(jià)[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2013， 26（2）： 591-594.

[17]彭麗莎， 袁天成， 李成瓊， 等. 十字花科作物根腫病生防菌研究進(jìn)展[J]. 植物保護(hù)， 2015， 41（4）： 16-22.

[18]蔣歡， 彭玉梅， 董代文， 等. 土壤酸堿度與榨菜根腫病的關(guān)系分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2017， 48（9）： 87-93.

[19]楊亨， 康曉慧， 白雪. 28個(gè)綿陽(yáng)地區(qū)主栽油菜品種抗根腫病鑒定及聚類分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 43（26）： 101-103.

[20]顧志光， 徐文鳳， 范玲超， 等. 拮抗放線菌固態(tài)發(fā)酵菌劑及其盆栽促生效果[J]. 北方園藝， 2017（8）： 124-128.

[21]宋淵， 曹貴明， 陳芝， 等. 阿維菌素高產(chǎn)菌株的選育及阿維菌素B1的鑒定[J]. 生物工程學(xué)報(bào)， 2000， 16（1）： 31-35.

收稿日期：2019-05-15

基金項(xiàng)目：山東省科技重大創(chuàng)新工程項(xiàng)目“設(shè)施蔬菜水肥精準(zhǔn)施用關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（2017CXGC0205）

作者簡(jiǎn)介：劉振香（1989—），女，農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)用微生物防治植物病害等研究。E-mail：liuzhenxiang@kingenta.com

通訊作者：胡紅濤（1989—），男，農(nóng)藝師，主要從事微生物肥料研制及應(yīng)用方面的研究。E-mail： hht4275@163.com