• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    花生DNA快速提取方法及應(yīng)用

    2019-12-09 01:52:35李柯趙昆昆寧龍龍馬倩李忠峰馬興立張幸果殷冬梅
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年9期
    關(guān)鍵詞:花生

    李柯 趙昆昆 寧龍龍 馬倩 李忠峰 馬興立 張幸果 殷冬梅

    摘要:為了能夠高效快速提取群體花生DNA,本研究在堿裂解法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步簡(jiǎn)化步驟,以不同濃度 NaOH溶液為提取液,采用直接吸取上清進(jìn)行PCR和吸取部分上清中和后進(jìn)行PCR,分析了兩種方法的提取效果。結(jié)果表明,用1.000 mol/L NaOH溶液裂解后,吸取部分上清中和后的DNA擴(kuò)增效果更好,與用SLS常規(guī)法提取的DNA質(zhì)量效果相同。該方法簡(jiǎn)便快捷,在很短的時(shí)間內(nèi)能夠提取大量花生群體材料的DNA,并具有較高的穩(wěn)定性,可在花生分子標(biāo)記輔助選擇育種中廣泛應(yīng)用,為不同基因型花生的高通量快速篩選奠定了基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:花生;DNA快速提取;堿裂解法

    中圖分類號(hào):S565.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A文章編號(hào):1001-4942(2019)09-0068-05

    A Rapid Extraction Method of Peanut DNA and Its Application

    Li Ke, Zhao Kunkun, Ning Longlong, Ma Qian, Li Zhongfeng, Ma Xingli, Zhang Xingguo, Yin Dongmei

    (College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

    Abstract In order to extract population peanut DNA efficiently and quickly, the steps were further simplified based on the alkaline lysis method. With different concentrations of NaOH solution as the extract, the extraction supernatant was used directly for PCR or partial supernatant was neutralized for PCR, and the extraction effects of the two methods were analyzed. The results showed that the DNA amplification effect was better after lysis with 1.000 mol/L NaOH solution and partial neutralization, which was the same as the DNA quality extracted by SLS conventional method. This method was simple and rapid, could extract the DNA of a large number of population materials in a short time, and had high stability, so it could be widely applied in molecular marker-assisted selection breeding of peanuts. It laid the foundation for high-throughput rapid screening of different genotypes.

    Keywords Peanut; Rapid DNA extraction; Alkaline lysis method

    花生是世界上主要油料作物之一,其出油率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于油菜、大豆、芝麻、向日葵等其他油料作物。在我國(guó)油料生產(chǎn)中,花生種植面積僅次于油菜,而單產(chǎn)和總產(chǎn)居第一位。隨著植物分子研究的進(jìn)一步發(fā)展,可通過(guò)分子標(biāo)記選擇育種、大規(guī)模雜交后代單株基因型鑒定等方式獲得高蛋白、高油酸、抗病抗逆、適產(chǎn)的花生品種[1]。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)能夠快速對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行篩選,而植物基因組DNA的提取是該方法的基礎(chǔ)[2]。一般實(shí)驗(yàn)室提取DNA 的方法有CTAB法[3]、SLS法、SDS法[4]、高鹽低pH法[5],這些方法提取的DNA濃度高、完整性好,但缺點(diǎn)也非常明顯,操作步驟繁瑣復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng),每次提取大致需要3~4 h。

    PCR反應(yīng)靈敏,在反應(yīng)體系中有很少量的DNA存在就能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。分子標(biāo)記輔助選擇、雜種后代純度鑒定等工作中所需的DNA量很少,并且提取的 DNA 也不需要長(zhǎng)時(shí)間保存[6]。當(dāng)需要對(duì)大群體進(jìn)行基因組DNA的提取時(shí),傳統(tǒng)提取方法工作量巨大,效率大大降低。另外,在提取過(guò)程中要用一些有毒試劑,會(huì)對(duì)研究者的身體造成危害[7]。因此,尋找一種簡(jiǎn)單、高效、低成本提取花生DNA 的方法很有必要。前人對(duì)DNA快速提取方法已經(jīng)進(jìn)行了許多研究。王蕾等[8]開發(fā)了一種改良TPS法提取花生DNA,不需液氮研磨,提取的DNA質(zhì)量較好,并且可用于SSR分析。劉宇等[9]在CTAB法的基礎(chǔ)上開發(fā)出一種DNA快速提取方法,并能夠用于高通量測(cè)序。這些方法雖有所改進(jìn),但步驟還是比較繁瑣。Wang等[10]建立了一種利用NaOH快速提取植物基因組DNA的方法并成功應(yīng)用于PCR反應(yīng)。鄭琪等[11]利用堿裂解法對(duì)中藥炒制品的DNA進(jìn)行快速提取,并成功應(yīng)用于PCR反應(yīng)。徐宗昌等[12]利用堿法提取煙草基因組DNA并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因煙草檢測(cè)。孫莉萍等[13]利用堿裂解法提取番茄DNA并探討了不同稀釋濃度對(duì)后續(xù)PCR試驗(yàn)的影響。此外,該方法在大麥[14]、甘蔗[15]、甜菜[16]、水稻[17]、玉米[18]中都有研究。前人的研究證明堿裂解法提取的植物基因組DNA能夠成功應(yīng)用于PCR反應(yīng),但該方法在花生中的應(yīng)用還未見報(bào)道。本研究對(duì)不同NaOH提取液濃度和是否需要在DNA提取液中加入緩沖液進(jìn)行了探討,建立了一種適用于花生的堿裂解快速DNA提取方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 植物材料 [HT]供試材料為白沙1016、H2014、花814、鄭農(nóng)花7號(hào)、ZP08、7500、農(nóng)大花103等10份低油酸和10份高油酸花生材料。

    1.1.2 主要試劑與儀器 [HT]固體NaOH購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.8)以及瓊脂糖凝膠電泳所用的核酸染色劑(GoldViewⅠ型核酸染色劑)購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司;50×TAE緩沖液;BM 2000 DNA Marker購(gòu)于博邁德基因技術(shù)有限公司;Mix(2×Taq PCR StarMix with Loading Dye)購(gòu)自GenStar生物公司;PCR擴(kuò)增儀型號(hào)為2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems);多樣品組織研磨儀(JXFSTPRP-24)購(gòu)于上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;電泳儀型號(hào)為DYY-8C,購(gòu)自北京市61儀器廠;凝膠成像系統(tǒng)型號(hào)為Azure Biosystems C200。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 試劑配制 0.1 mol/L Tris-HCl的配制:吸取適量的1.5 mol/L Tris-HCl,稀釋15倍即可獲得。

    1 mol/L NaCl溶液的配制:稱取固體NaCl 584 g,用100 mL蒸餾水充分溶解。

    NaOH溶液的配制:根據(jù)需要,稱取一定量的NaOH固體,配制成1.000 mol/L的NaOH溶液,稀釋成0.500、0.250、0.100、0.050、0.010 mol/L和0.005 mol/L的NaOH溶液。

    0.5 mol/L EDTA·Na2溶液的配制:稱取744 g的EDTA·Na2,再以40 mL的蒸餾水進(jìn)行充分溶解,即可制得。

    50×TAE緩沖液的配制:用滅菌去離子水將242 g 固體Tris和37.2 g固體EDTA·Na2充分溶解后,加入57.1 mL的冰醋酸,最后定容至1 L即可。

    SLS提取液的配制:稱取SLS固體10 g倒入燒杯中,再加入100 mL的 1 mol/L Tris-HCl、100 mL的1 mol/L NaCl以及40 mL的0.5 mol/L EDTA·Na2,使其充分溶解后加入2‰的PVP,再轉(zhuǎn)至容量瓶中定容至1 L。然后高壓滅菌鍋中滅菌20 min后冷卻至室溫,再調(diào)節(jié)pH到8.0。

    1.2.2 DNA提取 堿裂解法一:(1)分別剪取花生的根、莖、葉放置于2 mL的離心管中;(2)放入一個(gè)直徑為3 mm的鋼珠,再加入200 mL事先制備好的NaOH堿提取液;(3)將離心管在全自動(dòng)研磨儀中60 Hz研磨30 s;(4)直接吸取1 μL的上清液用于PCR反應(yīng)。

    堿裂解法二:(1)(2)(3)步與堿裂解法一相同;(4)從研磨后的離心管中吸取10 μL上清于另一離心管中,取200 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液加入離心管中。(5)搖勻后吸取1 μL用于PCR反應(yīng)。

    SLS法:(1)剪取適量花生的根、莖、葉放置于2 mL的離心管中。(2)加入200 μL事先配置好的SLS提取液,放入一個(gè)直徑為3 mm的鋼珠,經(jīng)研磨儀研磨后再加入400 μL SLS提取液和2%的巰基乙醇。(3)放入搖床搖晃30 min后再加入與SLS提取液等量的事先配置好的酚-氯仿-異戊醇(體積比為25∶[KG-*2/3]24∶[KG-*2/3]1)試劑。(4)放入搖床搖晃30 min,再以12 000 r/min離心10 min。(5)吸取上清液置于新的EP管中,加入等體積異戊醇(-20℃),上下緩慢翻轉(zhuǎn)(注意不要太過(guò)用力,以免破壞DNA的完整性),再放入-20℃冰箱冷凍至少30 min。(6)取出后以12 000 r/min離心10 min,而后將上清液倒出,DNA則殘留在離心管底部。(7)用75%的乙醇漂洗兩到三遍,最后放置于通風(fēng)處晾干后,加入100 μL的ddH2O溶解DNA。

    1.2.3 PCR反應(yīng) (1) 引物設(shè)計(jì):引物設(shè)計(jì)所用軟件為Primer Premier 5.0。由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物名稱和序列見表1。

    (2)PCR反應(yīng)體系:采用30 μL反應(yīng)體系,其中DNA模板1 μL,正向引物和反向引物各1 μL,2×Mix 15 μL,ddH2O 12 μL。

    (3)PCR反應(yīng)程序:本試驗(yàn)所用引物的PCR反應(yīng)程序設(shè)置見表2。

    1.2.4 PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè) 以5 μL Marker(BM 2000 DNA Marker)作為標(biāo)記,然后吸取8 μL DNA溶液點(diǎn)入瓊脂糖凝膠的膠孔中,電泳25 min(U=120V),將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照分析。

    1.2.5 NaOH提取液濃度篩選?取花生材料白沙1016的根、莖、葉于2 mL的離心管中,分別加入不同濃度的NaOH溶液(濃度梯度為1.000、0.500、0.250、0.100、0.050、0.010、0.005 mol/L),采用堿裂解法一和堿裂解法二進(jìn)行DNA提取及PCR擴(kuò)增,對(duì)比擴(kuò)增結(jié)果從而篩選出不同方法不同組織合適的NaOH濃度。PCR反應(yīng)所用引物為Arahy.5913QL-F/Arahy.5913QL-R。

    1.2.6 其他花生材料DNA的快速提取 利用上一步篩選出的合適濃度,對(duì)其他花生材料H2014、花 814、鄭農(nóng)花7號(hào)、ZP08、7500以及農(nóng)大花103的葉片進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。

    1.2.7 堿裂解法與SLS法提取的DNA擴(kuò)增效果對(duì)比 對(duì)用合適的NaOH溶液和利用SLS法提取的白沙1016葉DNA各取1μL作為模板,用引物Arahy.5913QL-F/Arahy.5913QL-R;Arahy. 42CZAS-F/Arahy.42CZAS-R;Arahy.PYV8LV-F/Arahy.PYV8LV-R; Arahy.RQKH3A-F/Arahy.RQKH3A-R; Arahy.N2H9FB-F/Arahy.N2H9FB-R進(jìn)行PCR反應(yīng),經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)比尋找差異。

    1.2.8 堿裂解法檢測(cè)單堿基插入 利用堿裂解法提取20份不同油酸含量的花生材料DNA,利用實(shí)驗(yàn)室建立的快速檢測(cè)單堿基插入/缺失的方法,檢測(cè)FAD2-2B基因中442位A堿基的插入。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 適宜NaOH濃度的篩選

    2.1.1 堿裂解法一NaOH適宜濃度的篩選 如圖1所示,只有0.050 mol/L的NaOH溶液提取的花生根部DNA能夠擴(kuò)增出條帶。而提取莖部DNA時(shí),除1.000 mol/L和0.500 mol/L的NaOH溶液外,其他濃度都可以擴(kuò)出較亮的條帶。0.010~0.250 mol/L的NaOH溶液提取葉部DNA時(shí)可擴(kuò)增出條帶,其他濃度無(wú)法擴(kuò)出條帶。由此可知,直接吸取上清的方法在提取根部DNA時(shí)不適用,更適用于花生葉部和莖部DNA的提取。綜合考慮,若提取葉部和莖部DNA,堿裂解法一0.250 mol/L的NaOH提取液為最適濃度。

    2.1.2 堿裂解法二NaOH適宜濃度的篩選 如圖2所示,用0.005~1.000 mol/L的NaOH溶液提取花生根、莖、葉的DNA作為模板都可以擴(kuò)增出條帶,但不同組織間存在差異。對(duì)于根部與莖部DNA,隨著NaOH提取液濃度的降低,擴(kuò)增出的條帶亮度也隨之降低,且DNA擴(kuò)增的效果沒有葉部DNA擴(kuò)增效果好。鑒于擴(kuò)增效果以及后續(xù)試驗(yàn)對(duì)于DNA的要求,本試驗(yàn)將1.000 mol/L的NaOH作為堿裂解法二的最適濃度。

    2.2 堿裂解法二提取其他花生材料DNA后的擴(kuò)增效果

    對(duì)上述兩種方法提取的DNA擴(kuò)增后的結(jié)果圖進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)吸取適量上清液加入緩沖液中和后進(jìn)行PCR 反應(yīng)比較穩(wěn)定,擴(kuò)增的條帶更為理想。由于本試驗(yàn)的目的是為了在大群體篩選時(shí)快速提取DNA用于PCR檢測(cè),所取樣品都為葉片,因此本研究將在之后的試驗(yàn)中利用堿裂解法二對(duì)葉片DNA進(jìn)行提取。如圖3所示,取用不同花生材料的葉片,采用堿裂解法二提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增均獲得了理想結(jié)果,說(shuō)明堿裂解法二具有廣泛的適用性。

    2.3 堿裂解法二與SLS法提取的DNA擴(kuò)增效果對(duì)比

    如圖4所示,堿裂解法二與SLS法提取的DNA分別用5種不同的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均能獲得清晰明亮的條帶。由此說(shuō)明堿裂解法二提取的DNA完全可以應(yīng)用于PCR擴(kuò)增,且擴(kuò)增效果與SLS法相同。

    2.4 堿裂解法二在單堿基插入檢測(cè)中的應(yīng)用

    利用前文建立的快速DNA提取方法,提取20份不同油酸含量的花生材料DNA,用引物對(duì)Arahy.5913QL-F/Arahy.5913QL-R進(jìn)行PCR反應(yīng),檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量(圖5),全部都能擴(kuò)增出條帶,說(shuō)明提取的DNA可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。用檢測(cè)FAD2-2B基因中442位A堿基插入的引物對(duì)Arahy.5913QL-179F/Arahy.5913QL-179R檢測(cè)20份花生材料(圖6)。前期測(cè)序檢測(cè)到高油酸材料中都有442位A堿基的插入,低油酸材料中都沒有442位A堿基的插入,說(shuō)明該引物對(duì)只能在高油酸材料中擴(kuò)增出條帶,本研究建立的快速檢測(cè)方法結(jié)果與之完全相符(圖6)。因此,本試驗(yàn)建立的花生DNA快速提取方法能夠滿足分子標(biāo)記輔助選擇對(duì)基因組DNA的要求。

    3 討論與結(jié)論

    本研究的主要目的是尋找一種簡(jiǎn)單、高效、低成本提取花生DNA 的方法,并將其應(yīng)用到雜種后代篩選及分子標(biāo)記輔助選擇中[19]。本試驗(yàn)對(duì)堿裂解法進(jìn)一步改進(jìn),使其更簡(jiǎn)潔易行,并在花生中有很好的適用性。堿裂解法一中,使用1.000 mol/L和0.500 mol/L的NaOH提取液均不能擴(kuò)增出條帶,可能是因?yàn)檫@兩個(gè)濃度的溶液堿性超過(guò)了PCR反應(yīng)中所加Mix的緩沖能力,使酶失活,不能進(jìn)行擴(kuò)增;堿裂解法二中,所有濃度的NaOH提取液在根、莖、葉中均能擴(kuò)增出條帶。堿裂解法一提取根部DNA時(shí),只有0.050 mol/L NaOH提取液能夠提取出DNA,且條帶亮度較弱,而莖部和葉部DNA的提取對(duì)于NaOH提取液的濃度也有要求范圍,若提取花生不同組織的DNA,堿裂解法一就需配制不同濃度的NaOH提取液,操作步驟復(fù)雜,而且提取的DNA擴(kuò)增效果并不理想。因此堿裂解法二更符合試驗(yàn)要求,能夠穩(wěn)定可靠地提取DNA。從試驗(yàn)結(jié)果的可靠性以及試劑配制的方便性上,建議采用1.000 mol/L的NaOH溶液作為提取液。

    本試驗(yàn)方法與傳統(tǒng)提取DNA的方法相比,不需要復(fù)雜多樣的有毒試劑,使用的儀器少,能夠有效避免試驗(yàn)過(guò)程的污染;同時(shí)提取時(shí)間只需要10~20 min,提高了花生大群體基因型篩選和分子標(biāo)記輔助選種的效率。雖然傳統(tǒng)的提取法提取的DNA質(zhì)量好,但是對(duì)于PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō),只要有少量DNA模板的存在,就可以成功擴(kuò)增,對(duì)于DNA的質(zhì)量要求并不高。

    本試驗(yàn)建立了一個(gè)穩(wěn)定、快速、低成本的適用于簡(jiǎn)單PCR反應(yīng)的花生DNA提取方法,提取的花生基因組DNA能夠應(yīng)用于單堿基插入的檢測(cè),為后續(xù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行雜交后代選擇和分子標(biāo)記輔助篩選提供了極大方便。

    參 考 文 獻(xiàn):

    [1]董文召, 湯豐收, 張新友. 花生育種目標(biāo)的市場(chǎng)誘導(dǎo)創(chuàng)新因素[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2004, 20(3): 97-99.

    [2]陳明娜, 遲曉元, 潘麗娟, 等. 中國(guó)花生育種的發(fā)展歷程與展望[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2014, 30(9):1-6.

    [3]熊發(fā)前, 劉俊仙, 劉菁, 等. 花生DNA的五種改良CTAB提取方法的比較分析及其應(yīng)用[J].分子植物育種, 2019, 17(7): 2207-2216.

    [4]梁雪蓮, 鄭奕雄, 陳曉玲, 等. 花生DNA提取方法比較[J].生物技術(shù), 2007(1): 41-44.

    [5]王傳堂, 黃粵, 楊新道, 等. 改良CTAB法和高鹽低pH值法提取花生DNA的效果[J].花生學(xué)報(bào), 2002, 31(3): 20-23.

    [6]陳平華,王恒波,許莉萍,等.堿裂解葉片兩步快速制備PCR模板技術(shù)研究[J].熱帶作物學(xué)報(bào), 2010, 31(3): 422-429.

    [7]吳則東, 王華忠, 倪洪濤. 不同堿裂解法快速提取甜菜大群體DNA的研究[J].中國(guó)糖料, 2013(3): 32-34.

    [8]王蕾, 趙新濤, 許夢(mèng)琦, 等. 花生葉片 DNA 快速提取方法的優(yōu)化[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014,46(7):11-14.

    [9]劉宇, 李春娟, 閆彩霞, 等. 一種快速高效提取花生葉片DNA的簡(jiǎn)化方法[J].花生學(xué)報(bào), 2019, 48(1): 58-61.

    [10]Wang H, Qi M, Cutler A J. A simple method of preparing plant samples for PCR[J].Nucleic Acids Research, 1993, 21(17):4153-4154.

    [11]鄭琪, 蔣超, 黃璐琦, 等. 堿裂解法快速提取中藥炒制品DNA的研究[J].中國(guó)中藥雜志, 2014, 39(19): 3678.

    [12]徐宗昌, 王萌, 孔英珍. 煙草堿法提取基因組DNA的改進(jìn)[J].生物技術(shù)通報(bào), 2017,33(2): 59-65.

    [13]孫利萍, 賈芝琪, 胡建斌, 等. 堿裂解法快速提取番茄DNA的研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 46(2):136-138.

    [14]Post R V, Post L V, Dayteg C, et al. A high-throughput DNA extraction method for barley seed[J].Euphytica, 2003, 130(2):255-260.

    [15]崔學(xué)強(qiáng), 張樹珍, 馮翠蓮. 一種簡(jiǎn)易的甘蔗葉組織PCR模板制備方法[J].生物技術(shù)通報(bào), 2016, 32(3): 58-62.

    [16]劉乃新, 馬龍彪, 趙雨, 等. 利用PCR儀快速提取甜菜基因組DNA[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2016,32(35): 15-18.

    [17]何光華, 桑賢春, 張毅, 等. 水稻PCR擴(kuò)增模板的快速制備[J].遺傳, 2003, 25(6): 705-707.

    [18]郭景倫, 趙久然, 王鳳格. 適用于SSR分子標(biāo)記的玉米單粒種子DNA快速提取新方法[J].玉米科學(xué), 2005, 13(2): 16-17.

    [19]Carter M, Paris M. Cereal DNA: A rapid high-throughput extraction method for marker assisted selection[J].Plant Molecular Biology Reporter, 2012, 18(18): 357-360.

    收稿日期:2019-07-24

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U1704232);河南省產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(S2012-05-G03)

    作者簡(jiǎn)介:李柯(1995—),男,河南南陽(yáng)人,碩士研究生。

    通訊作者:殷冬梅(1972—),女,河南南陽(yáng)人,博士,教授,主要從事花生遺傳育種工作。E-mail:yindm@126.com

    猜你喜歡
    花生
    趣玩花生
    幼兒100(2023年41期)2023-11-21 09:33:46
    掏花生
    花生貓便簽夾
    童話世界(2019年32期)2019-11-26 01:03:10
    邂逅花生
    多少堆花生
    花生鼠與奶酪鼠(外一則)
    拿花生
    到底埋在哪棵樹下
    花生去哪兒了
    花生大夫
    嫩草影院入口| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久精品国产清高在天天线| 99精品欧美一区二区三区四区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 成在线人永久免费视频| 麻豆国产97在线/欧美| 久久精品综合一区二区三区| 舔av片在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 日本a在线网址| www.www免费av| 99精品久久久久人妻精品| 欧美黄色淫秽网站| 日本三级黄在线观看| 日本三级黄在线观看| 国产1区2区3区精品| 亚洲专区字幕在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 99视频精品全部免费 在线 | 久久久水蜜桃国产精品网| 久久中文字幕人妻熟女| 国模一区二区三区四区视频 | 国产精品久久久av美女十八| 国产一区二区激情短视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 日本一二三区视频观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 成年人黄色毛片网站| av片东京热男人的天堂| 欧美大码av| 9191精品国产免费久久| 全区人妻精品视频| 国产三级在线视频| 亚洲av免费在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 免费在线观看成人毛片| 怎么达到女性高潮| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久久国产欧美日韩av| 久久精品综合一区二区三区| 欧美色视频一区免费| 欧美中文综合在线视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美+亚洲+日韩+国产| www.999成人在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产高清三级在线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| av在线蜜桃| 国产免费av片在线观看野外av| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 午夜两性在线视频| 色在线成人网| 最近视频中文字幕2019在线8| 最近在线观看免费完整版| 天堂影院成人在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 欧美三级亚洲精品| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 真实男女啪啪啪动态图| 老熟妇仑乱视频hdxx| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品一区二区三区四区久久| 午夜激情福利司机影院| 在线观看舔阴道视频| 午夜福利在线在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 色视频www国产| 一本精品99久久精品77| 超碰成人久久| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久精品影院6| 欧美激情在线99| 亚洲成av人片免费观看| 成年免费大片在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 韩国av一区二区三区四区| 日本成人三级电影网站| 国产三级在线视频| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲av电影在线进入| 免费看十八禁软件| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲最大成人中文| 欧美+亚洲+日韩+国产| 美女午夜性视频免费| 一a级毛片在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美一区二区国产精品久久精品| 欧美zozozo另类| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品永久免费网站| 看免费av毛片| 欧美日本视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 欧美大码av| 制服人妻中文乱码| 国产激情欧美一区二区| 免费av不卡在线播放| 久久热在线av| 国产亚洲精品av在线| 精品电影一区二区在线| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 精品久久久久久久毛片微露脸| 十八禁人妻一区二区| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 色老头精品视频在线观看| 国产精品影院久久| АⅤ资源中文在线天堂| a级毛片在线看网站| xxxwww97欧美| 国产av麻豆久久久久久久| 久久香蕉精品热| 国产一区在线观看成人免费| 久久久久久国产a免费观看| 午夜福利在线观看吧| 国产69精品久久久久777片 | 男人舔女人的私密视频| 亚洲av美国av| 男女视频在线观看网站免费| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产精品久久久久久久电影 | 色吧在线观看| 51午夜福利影视在线观看| av女优亚洲男人天堂 | 18禁国产床啪视频网站| 国产三级黄色录像| 青草久久国产| 国产精品永久免费网站| 中文资源天堂在线| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日韩欧美精品v在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 麻豆av在线久日| 人妻久久中文字幕网| 亚洲无线观看免费| 老熟妇仑乱视频hdxx| 色吧在线观看| av视频在线观看入口| e午夜精品久久久久久久| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 中文字幕熟女人妻在线| 18美女黄网站色大片免费观看| 99精品久久久久人妻精品| av黄色大香蕉| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲无线在线观看| 最近在线观看免费完整版| 一本精品99久久精品77| 国产乱人伦免费视频| 精品人妻1区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 日本一二三区视频观看| 日韩欧美在线二视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 精品人妻1区二区| 欧美一区二区国产精品久久精品| 久久九九热精品免费| svipshipincom国产片| 日本熟妇午夜| 国产三级在线视频| 久久久久久久午夜电影| 成年人黄色毛片网站| 高清在线国产一区| 成人国产综合亚洲| 村上凉子中文字幕在线| 久久久久久大精品| 久9热在线精品视频| 九色国产91popny在线| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品影院久久| 国产三级黄色录像| 精品欧美国产一区二区三| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲无线观看免费| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 免费高清视频大片| 日韩高清综合在线| 99热这里只有精品一区 | 国产精品久久久av美女十八| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 男人和女人高潮做爰伦理| 日韩欧美国产在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 日韩欧美精品v在线| 天天添夜夜摸| 可以在线观看的亚洲视频| 日本一本二区三区精品| 国产亚洲av高清不卡| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 免费在线观看成人毛片| 亚洲午夜理论影院| 日韩人妻高清精品专区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲人成网站高清观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 在线永久观看黄色视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国内精品久久久久精免费| 全区人妻精品视频| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 国产私拍福利视频在线观看| 国模一区二区三区四区视频 | 88av欧美| 18美女黄网站色大片免费观看| 色尼玛亚洲综合影院| 一个人看的www免费观看视频| 日本 av在线| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 成人国产综合亚洲| 久久这里只有精品中国| 免费人成视频x8x8入口观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 成人国产综合亚洲| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 热99在线观看视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 级片在线观看| 欧美三级亚洲精品| 变态另类丝袜制服| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 精品久久久久久久久久免费视频| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲av成人av| 精品久久久久久久久久久久久| 99热精品在线国产| 午夜福利高清视频| 国产av不卡久久| 久久久国产成人免费| 国产av麻豆久久久久久久| 日韩人妻高清精品专区| 午夜福利免费观看在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲国产精品999在线| 岛国在线免费视频观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 婷婷亚洲欧美| 国产精品一及| 欧美日韩福利视频一区二区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| av中文乱码字幕在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 精品电影一区二区在线| 舔av片在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 免费av毛片视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 中文字幕高清在线视频| 好男人电影高清在线观看| a级毛片a级免费在线| 很黄的视频免费| 国产午夜精品论理片| 国产不卡一卡二| 国产精品 国内视频| 观看免费一级毛片| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲成a人片在线一区二区| 免费看光身美女| 热99在线观看视频| 久久性视频一级片| 亚洲午夜理论影院| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美黑人巨大hd| 精品国产乱子伦一区二区三区| 精品电影一区二区在线| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 色综合站精品国产| 99热精品在线国产| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 三级国产精品欧美在线观看 | 日韩欧美 国产精品| 欧美在线一区亚洲| 99国产精品一区二区三区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成人欧美大片| 国产精品一区二区三区四区久久| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产男靠女视频免费网站| 午夜精品久久久久久毛片777| h日本视频在线播放| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产熟女xx| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 99久国产av精品| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲av五月六月丁香网| 免费av毛片视频| 国产真实乱freesex| 久久精品国产综合久久久| 国产私拍福利视频在线观看| 在线观看日韩欧美| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久天堂一区二区三区四区| 最近在线观看免费完整版| 特级一级黄色大片| 他把我摸到了高潮在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 制服人妻中文乱码| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 97超视频在线观看视频| 一进一出抽搐动态| 老汉色∧v一级毛片| 久久久久国内视频| 老司机在亚洲福利影院| 极品教师在线免费播放| 国产1区2区3区精品| 亚洲精品美女久久av网站| www.精华液| 精品久久久久久,| 国产成人av教育| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 91在线精品国自产拍蜜月 | 特大巨黑吊av在线直播| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 免费人成视频x8x8入口观看| 级片在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 免费观看人在逋| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久久久久久久中文| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 99精品久久久久人妻精品| 99热这里只有是精品50| 麻豆成人av在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美黑人欧美精品刺激| 十八禁人妻一区二区| xxx96com| 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久中文字幕一级| 九色国产91popny在线| 日本五十路高清| or卡值多少钱| 久久热在线av| 精品国产美女av久久久久小说| 真人一进一出gif抽搐免费| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产精品一及| bbb黄色大片| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久久久久国产a免费观看| 后天国语完整版免费观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 老司机福利观看| 亚洲色图av天堂| 日本免费a在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久午夜亚洲精品久久| 国产熟女xx| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久久色成人| 又黄又粗又硬又大视频| 99久久精品热视频| 女人被狂操c到高潮| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲精品456在线播放app | 免费一级毛片在线播放高清视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 欧美日韩乱码在线| 91老司机精品| 91av网一区二区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 男人舔女人的私密视频| 麻豆av在线久日| 午夜日韩欧美国产| www日本黄色视频网| 69av精品久久久久久| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久99热这里只有精品18| 久久这里只有精品19| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久久久久国产a免费观看| 91麻豆av在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 九色成人免费人妻av| 亚洲精品久久国产高清桃花| 在线国产一区二区在线| www.999成人在线观看| 成人鲁丝片一二三区免费| av天堂中文字幕网| 亚洲av电影在线进入| 男女那种视频在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 毛片女人毛片| 日韩国内少妇激情av| 一区福利在线观看| 麻豆国产av国片精品| 国产精品亚洲美女久久久| 国产野战对白在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 色综合婷婷激情| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产成人精品无人区| 丁香六月欧美| 国产成年人精品一区二区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产成人系列免费观看| 亚洲五月婷婷丁香| 中文资源天堂在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 老司机福利观看| 成人国产一区最新在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 黄色日韩在线| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美最黄视频在线播放免费| av欧美777| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久国产精品影院| 国产三级黄色录像| 午夜成年电影在线免费观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 免费搜索国产男女视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 99精品欧美一区二区三区四区| xxxwww97欧美| 动漫黄色视频在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日本一二三区视频观看| 国产午夜精品论理片| 亚洲av免费在线观看| 免费看日本二区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 极品教师在线免费播放| xxx96com| 男人舔女人下体高潮全视频| 黄色片一级片一级黄色片| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产综合懂色| 99re在线观看精品视频| 无人区码免费观看不卡| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 看黄色毛片网站| 99热只有精品国产| 亚洲在线观看片| 九九热线精品视视频播放| 9191精品国产免费久久| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品电影一区二区在线| 欧美色欧美亚洲另类二区| 在线观看一区二区三区| 看免费av毛片| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产伦在线观看视频一区| av视频在线观看入口| 亚洲电影在线观看av| 久久久国产成人免费| 又粗又爽又猛毛片免费看| 美女高潮的动态| 国产又色又爽无遮挡免费看| xxx96com| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲成av人片在线播放无| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 男人和女人高潮做爰伦理| www.自偷自拍.com| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 日本 欧美在线| 亚洲成人久久性| 免费在线观看影片大全网站| 国产成人av教育| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 亚洲av成人精品一区久久| 久久久久久大精品| 不卡av一区二区三区| 丝袜人妻中文字幕| 日本五十路高清| 久久伊人香网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久久免费精品人妻一区二区| a级毛片在线看网站| 色哟哟哟哟哟哟| 久99久视频精品免费| 搡老岳熟女国产| 亚洲在线自拍视频| 五月玫瑰六月丁香| 黑人操中国人逼视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 悠悠久久av| 欧美黄色淫秽网站| 日韩欧美三级三区| 欧美乱色亚洲激情| 久久久久九九精品影院| 亚洲专区中文字幕在线| 国产激情久久老熟女| 免费高清视频大片| 亚洲最大成人中文| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 午夜成年电影在线免费观看| 宅男免费午夜| 少妇的逼水好多| 欧美成人性av电影在线观看| 黄色 视频免费看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产精品,欧美在线| 欧美日本视频| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 哪里可以看免费的av片| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 一本一本综合久久| 国产野战对白在线观看| xxx96com| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲熟女毛片儿| 免费在线观看亚洲国产| 久久精品国产清高在天天线| 成人精品一区二区免费| 午夜福利在线观看吧| 欧美又色又爽又黄视频| 日本在线视频免费播放| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲片人在线观看| 99久久精品一区二区三区| 日韩av在线大香蕉| 人妻夜夜爽99麻豆av| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 91av网一区二区| 久久国产精品人妻蜜桃| 99国产综合亚洲精品| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲av美国av| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲五月婷婷丁香| 日本与韩国留学比较| 亚洲天堂国产精品一区在线| a级毛片a级免费在线| 免费av不卡在线播放| 桃色一区二区三区在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 免费一级毛片在线播放高清视频| а√天堂www在线а√下载| 动漫黄色视频在线观看| 国产单亲对白刺激| 欧美黑人欧美精品刺激| 日韩精品中文字幕看吧| 久99久视频精品免费| 国内揄拍国产精品人妻在线| 9191精品国产免费久久| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日本与韩国留学比较| 中文字幕久久专区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 三级国产精品欧美在线观看 | 国产黄a三级三级三级人| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产成人av教育| 日韩欧美三级三区| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 男人和女人高潮做爰伦理| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 在线观看午夜福利视频| 成人国产一区最新在线观看| 国产综合懂色| 亚洲av第一区精品v没综合| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 午夜成年电影在线免费观看| 国产精品女同一区二区软件 | 一级作爱视频免费观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 日韩欧美在线乱码| 国产精华一区二区三区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 99精品在免费线老司机午夜| 国产精品久久视频播放| 国产三级在线视频| 国内精品久久久久精免费|