PARMS在水稻基因編輯后代基因分型中的應用研究

律文堂　尹靜靜　陰筱　徐國鑫　吳小賓　李效尊　吳修

摘要：基因編輯技術為植物基因功能研究和作物遺傳改良提供了有效途徑。目前基因編輯植株基因分型多采用PCR/RE法、PAGE檢測法、Sanger測序法等手段，但這些方法存在操作復雜、耗時長或成本高等問題。PARMS技術（penta-primer amplification refractory mutation system，五引物擴增受阻突變體系）是最新開發(fā)出的基于熒光檢測的SNP基因分型方法，具有操作簡便、耗時短、成本低的優(yōu)勢。本研究利用PARMS技術對水稻CRISPR/Cas9基因編輯植株進行了基因分型，鑒定結果與PAGE檢測和Sanger測序法一致，證明PARMS技術可用于水稻基因編輯植株后代基因分型，也為其它作物基因編輯后代基因分型技術選擇提供了參考。

關鍵詞：水稻;基因編輯;基因分型;五引物擴增受阻突變體系（PARMS）

中圖分類號：S511.035.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）10-0008-06

Application of PARMS Technology in Genotyping of

Rice Gene Edited Progeny

Lü Wentang， Yin Jingjing， Yin Xiao， Xu Guoxin， Wu Xiaobin， Li Xiaozun， Wu Xiu

（Shandong Rice Research Institute/ Hydrobiology Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China）

Abstract Gene editing technology provides an effective method for plant gene function research and crop genetic improvement. At present， genotyping of gene edited plants often adopts PCR/RE， PAGE or Sanger sequencing methods， which have disadvantages such as complicated operation， long time consuming or high cost. PARMS （Penta-primer amplification refractory mutation system） technology is a newly developed SNP genotyping method based on fluorescence detection， which has the advantages of simple operation， short time consuming and low cost. In this study， the rice CRISPR/Cas9 gene edited plants were genotyped by PARMS and the results were consistent with that detected by PAGE and Sanger sequencing methods， which proved that PARMS technology could be used for genotyping of rice gene edited progeny. This study also provided a reference for the selection of genotyping techniques of other crops.

Keywords Rice; Gene editing; Genotyping; Penta-primer amplification refractory mutation system （PARMS）

突變體是研究基因功能和進行作物新品種選育的重要材料，獲得突變體的傳統(tǒng)辦法主要依靠自然突變、物理或化學誘變及T-DNA隨機插入等手段，但這些手段存在突變效率低、突變位點隨機等缺陷?；蚓庉嫾夹g可以在特定的位點引入核苷酸變異，能夠實現(xiàn)基因定點編輯從而高效地獲得目標突變體，其快速發(fā)展與應用為植物功能基因研究和作物遺傳改良提供了重要的技術支撐[1]。CRISPR/Cas9技術由于具有載體構建過程簡單、編輯效率高等優(yōu)點，已成為當前主流的基因編輯技術，在擬南芥、水稻、玉米、小麥、煙草等植物基因編輯研究中被廣泛應用[2-4]。

從基因編輯植株后代中獲得靶基因純合突變體是遺傳和育種研究中的重要環(huán)節(jié)，其篩選工作量往往較大。目前鑒定基因編輯純合體的主要方法有PCR/RE法（polymerase chain reaction / restriction enzyme assay）、PAGE檢測法、Sanger測序法、高通量測序法、HRM法（high-resolution melting analysis）、ACT-PCR法（annealing at critical temperature PCR）等[5，6]，其中PCR/RE、PAGE和Sanger測序法最為常用，但存在操作復雜、耗時長或成本高等缺點。

PARMS技術（penta-primer amplification refractory mutation system，五引物擴增受阻突變體系）是基于ARMS技術（tetra-primer amplification refractory mutation system，四引物擴增受阻突變體系）[7]開發(fā)的一種SNP基因分型技術，該技術利用五條引物（一對通用熒光引物、一對等位基因特異引物和一條反向共用引物）對SNP或短Indel位點進行等位基因特異性擴增，通過熒光掃描進行基因分型[8]。與PCR/RE、PAGE等需要電泳進行基因分型的傳統(tǒng)方法相比，PARMS等基于熒光檢測的基因分型方法具有操作簡便、耗時短和成本低等優(yōu)勢，并且SNP及短Indel位點均能檢測。CRISPR/Cas9技術利用序列特異性核酸酶在靶基因PAM序列（protospacer-adjacent motif）上游3 bp位置上產(chǎn)生一個切割位點，隨后進行非同源末端連接修復，產(chǎn)生隨機的短Indel突變[5]，基因編輯位點的突變形式大部分情況下是1 bp的插入，小部分為短片段缺失[1，3，9]。因此，理論上PARMS技術可以用于基于CRISPR/Cas9技術基因編輯后代的基因分型和純合體鑒定，但目前尚未有該技術應用于基因編輯植株基因分型的報道。

3 討論與結論

本研究結果表明PARMS技術可用于水稻CRISPR/Cas9基因編輯后代的基因分型，為水稻基因編輯純合體鑒定提供了一種操作簡便、耗時短和成本低的方案。

利用基因編輯技術對二倍體植物進行基因編輯后，植株多產(chǎn)生簡單突變。為了獲知靶點的突變情況，用特異引物對包含靶點序列的DNA片段擴增后測序，測序峰圖可直接通過在線工具DSDecode解碼[10]。該方法可以簡化基因編輯T₀代株系的檢測流程，不用再進行繁瑣的TA克隆測序，提高了T₀代基因分型效率?；蚓庉婽₁等后代植株基因分型是篩選基因編輯純合突變體的手段，傳統(tǒng)的PCR/RE法、Sanger測序法等存在操作復雜、耗時長或成本高等不足。特別是隨著從多位點敲除的基因編輯株系后代中篩選多基因純合突變單株，篩選工作量及成本較單基因敲除將呈指數(shù)級增長，更加需求高效低成本的基因分型技術。PARMS技術可以把基因編輯位點處產(chǎn)生的短Indel轉化為SNP來檢測，針對每個檢測位點僅需要合成三條普通引物，且擴增程序只需在普通PCR儀上進行，PCR產(chǎn)物經(jīng)熒光信號值掃描即可實現(xiàn)基因分型[8]。將DSDecode解碼技術與PARMS技術結合，提高了基因編輯后代的鑒定效率，降低了試驗成本，為作物遺傳和分子育種研究中基因編輯材料的鑒定提供了一種新的技術選擇。

參 考 文 獻：

[1]劉耀光，李構思，張雅玲，等. CRISPR/Cas植物基因組編輯技術研究進展[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報， 2019， 40（5）：38-49.

[2]Belhaj K， Chaparro-Garcia A， Kamoun S， et al. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9[J]. Current Opinion in Biotechnology， 2015， 32：76-84.

[3]Ma X， Zhang Q， Zhu Q， et al. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient， high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[J]. Molecular Plant， 2015，8（8）：1274-1284.

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[8]Zhang B， Zhao N， Liu Y， et al. Novel molecular markers for high-throughput sex characterization of Cynoglossus semilaevis[J]. Aquaculture， 2019： 734331.

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[10]Liu W， Xie X， Ma X， et al. DSDecode： A web-based tool for decoding of sequencing chromatograms for genotyping of targeted mutations[J]. Molecular Plant， 2015，8（9）：1431-1433.

收稿日期：2019-08-10

基金項目：國家自然科學基金項目（31601650）;山東省農(nóng)業(yè)科學院青年英才培養(yǎng)計劃項目;山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目（CXGC2018E16）;雜交水稻國家重點實驗室（武漢大學）開放課題基金項目（KF201902）

作者簡介：律文堂（1982—），男，博士，助理研究員，研究方向為分子遺傳學。E-mail：lvwentang2015@163.com

通訊作者：李效尊（1979—），男，博士，副研究員，研究方向為水生植物栽培與育種。E-mail：xiaozunli@163.com

吳修（1965—），男，研究員，研究方向為作物栽培與育種。E-mail：wuxiu9090@163.com