GC-MS法同時測定天麻6種非揮發(fā)性有機酸

楊式華， 劉祥義， 徐濟倉， 楊 蕾， 鄧國賓， 侯 英*， 楊慶嬌

(1.云南佩林科技有限公司，云南 昆明 650201； 2.西南林業(yè)大學， 云南 昆明 650224； 3.云南中煙技術中心， 云南 昆明 650231； 4.云南空港物流有限公司， 云南 昆明 650100)

天麻(GastrodiaelataBl.)是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，為蘭科天麻屬多年生草本植物，藥用部位為天麻的干燥塊莖，對于失眠、高血壓、偏頭痛、神經病變及心腦血管疾病等有較好的治療效果[1-3]，常用于治病、滋補及保健有機結合的藥膳，極具營養(yǎng)價值。天麻中含有多種活性成分，有機酸即是其中一類[4]。研究表明，中藥有機酸類成分多為非揮發(fā)性有機酸(Nonvolatile Organic Acids , NVOAs)，具有抗氧化、保肝、免疫調節(jié)、抑菌、抗病毒等藥理作用[5]。特別是天麻NVOAs中的檸檬酸，其與巴利森苷(Parishins)及其衍生物有關。巴利森苷是天麻的主要有效成分，是天麻素與一分子檸檬酸縮合而成的酯類結構[6]，因而，準確測定天麻中有機酸含量，對評價天麻的藥用價值與食用價值，特別是測定天麻中檸檬酸含量對研究巴利森苷及其衍生物在不同條件下的降解規(guī)律具有重要意義。目前，天麻品質的評價主要集中于天麻素的含量和活性研究[7-8]，天麻中有機酸的研究多為定性分析[9]，僅見檸檬酸的定量分析[4]，未見天麻中多種非揮發(fā)性有機酸的快速定量測定方法。因此，采用樣品衍生化、GC-MS技術，建立快速定量測定天麻中6種非揮發(fā)性有機酸(草酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸)含量的方法，以期為天麻品質的鑒定、藥用價值及食用價值的評價提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 10份天麻樣品為2017年采集，其中1～8號樣采自云南昭通，9號樣采自湖北宜昌，10號樣采自陜西漢中，并經西南林業(yè)大學劉祥義教授鑒定。樣品采集后用自來水洗凈塊莖部位，再用蒸餾水沖洗3次，隔水蒸透心，60℃烘箱干燥。粉碎后過60目篩，編號存放于自封袋中備用。

1.1.2 儀器及設備 Agilent 6890-5973N氣質聯(lián)用儀(美國Agilent公司)，JP-040S型超聲波萃取儀(深圳市潔盟清洗設備有限公司)，MS204E型電子天平(感量0.000 1 g，瑞士METTLER TOLEDO 公司)，Ф13 mm×0.2 μm微濾膜過濾器(天津騰達過濾器件廠)，Milli-Q 純水儀(美國Millipore公司)。

1.1.3 試劑 甲醇、正己烷(德國Merck公司)，濃硫酸、對甲基苯磺酸(PTSA)均為色譜純(國藥集團化學試劑有限公司)。對照品：草酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸均為分析純，純度均大于98%(Fluka公司)。內標：己二酸(純度大于98.5%，Fluka公司)；內標溶液：用己二酸配制相應的內標甲醇溶液。衍生化試劑(H2SO4/ PTSA /CH3OH)：配制含10%濃硫酸和5%對甲苯磺酸的甲醇溶液。

1.2 方法

1.2.1 非揮發(fā)性有機酸的提取及測定條件的優(yōu)化

1) PTSA濃度。選擇10%硫酸+PTSA的甲醇溶液體系作為有機酸的衍生化(酯化)試劑。稱樣品1.00 g，加內標溶液1.0 mL、衍生化試劑8.0 mL，分別用PTSA濃度為1%、2%、5%、10%、15%的甲醇(含10%硫酸)酯化試劑對同一樣品在50℃下酯化45 min，考察不同PTSA濃度下的非揮發(fā)性有機酸含量。

2) 酯化溫度。稱樣品1.00 g，加內標1.0 mL、衍生化試劑8.0 mL，酯化時間45 min，考察酯化溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃和60℃的非揮發(fā)性有機酸含量。

3) 酯化時間。稱樣品1.00 g，加內標1.0 mL、衍生化試劑8.0 mL，酯化溫度50℃，分別考察酯化時間為15 min、30 min、45 min、60 min、75 min的非揮性有機酸含量。

4) 萃取方式和時間。采用超聲萃取和振蕩萃取樣品中的有機酸酯，比較不同萃取方式對樣品中非揮發(fā)性有機酸的提取效果。在最佳提取方式下，考察萃取時間分別為5 min、10 min、15 min、20 min和25 min的非揮發(fā)性有機酸含量。

1.2.2 GC-MS儀器分析條件 載氣，He；載氣流速1.2 mL/min；色譜柱：HP-5MS(30 m× 0.25 mm× 0.25 μm)，進樣量1.0 μL，分流比20∶1，恒流模式；接口溫度275℃，離子源溫度230℃ ，電離能70 eV，質量掃描范圍：30～400 amu，進樣口溫度270℃。程序升溫：60℃下保持1 min，以6℃/min的速率升至270℃，保持8 min。

1.2.3 標準曲線的建立 分別稱取草酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸100 mg，蘋果酸、檸檬酸1 000 mg于50 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，母液濃度：草酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸濃度為2 mg/mL，蘋果酸、檸檬酸濃度為20 mg/mL。

依次移取上述母液0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即為系列濃度標準工作溶液。分別取上述標準工作溶液1 mL，加1.0 mL內標溶液、8.0 mL衍生化試劑，于優(yōu)化的條件下酯化，冷至室溫，加20 mL正己烷，稱重；在優(yōu)化的提取條件下提取NVOAs，用GC-MS儀器測定，以濃度為橫坐標，響應值為縱坐標，建立標準曲線。

1.2.4 重現性及回收率的測定 昭通天麻是目前國內品質最好的天麻之一，選擇2號昭通天麻樣品考察方法的重現性和回收率。分別稱取2號樣品6份，采用優(yōu)化的前處理條件對樣品進行處理后，用GC-MS儀器測定，計算方法的重現性。另稱取7份同一樣品，其中6份加入不同濃度的標準品溶液1.0 mL(蘋果酸和檸檬酸濃度低、中、高依次為1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL，其余有機酸濃度依次為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL)，采用優(yōu)化的前處理條件對樣品進行處理后，用GC-MS儀器測定，計算方法的回收率。

1.2.5 樣品的測定 稱取1.00 g樣品于具塞錐形瓶中，加1.0 mL內標溶液、8.0 mL衍生化試劑，于優(yōu)化的酯化溫度下酯化，冷至室溫，加20 mL正己烷，稱重；在優(yōu)化的提取條件下提取非揮發(fā)性有機酸，靜置分層后，加正己烷補足重量；吸取上層正己烷清液2 mL，用濾膜過濾器過濾，棄去前0.5 mL后，濾入進樣瓶中，進GC-MS儀器進行分離和鑒定；采用質譜定性、內標法定量測定及校正曲線的制作。

2 結果與分析

2.1 不同因素對非揮發(fā)性有機酸酯化及提取效果的影響

2.1.1 PTSA濃度 從圖1可知，有機酸測定值隨PTSA濃度增加而升高，當PTSA濃度達5%，草酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸、亞油酸及油酸均酯化反應完全，增加PTSA濃度非揮發(fā)性有機酸含量沒有明顯變化，故選擇濃度為硫酸10%和PTSA5%的甲醇溶液作為酯化試劑。

圖1 不同酯化及萃取條件下的非揮發(fā)性有機酸含量

2.1.2 酯化溫度 溫度是影響有機酸酯化的關鍵因素，溫度過低酯化反應較慢且不完全。隨著酯化溫度的升高，非揮發(fā)性有機酸含量明顯增加，當酯化溫度為50℃時，草酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸、亞油酸及油酸均酯化完全，繼續(xù)升高溫度，非揮發(fā)性有機酸含量未見增加，故選擇酯化溫度為50℃(圖1)。

2.1.3 酯化時間 反應時間對酯化完成度有明顯影響，隨著酯化時間增加，非揮發(fā)性有機酸含量明顯增加，在45 min時有機酸即完全酯化(圖1)，增加酯化時間，草酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸、亞油酸及油酸含量未見明顯增加，酯化60 min非揮發(fā)性有機酸含量反而略有下降，故選擇酯化時間為45 min。

2.1.4 萃取方式和萃取時間 從圖1可看出振蕩萃取的草酸、蘋果酸、檸檬酸、亞油酸等含量低于超聲萃??；且超聲萃取10 min，草酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸、亞油酸及油酸含量達到萃取平衡，故最佳提取方式為超聲萃取10 min。

2.2 標準曲線

從表1看出，草酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸6種非揮發(fā)性有機酸標準曲線的相關系數均大于0.999 0，檢出限為0.04～2.00 mg/g，方法具有良好的線性關系。

表1 非揮發(fā)性有機酸的回歸方程、相關系數和檢出限

注：AR為相對峰面積；CR為相對濃度。

Note: ARand CRrefer to relative peak areas and relative concentration respectively.

2.3 重現性和回收率

從表2可知，非揮發(fā)性有機酸 6次測定的RSD在1.04%～3.59%，能夠滿足樣品分析精密度要求。6種非揮發(fā)性有機酸酸的加標回收率為89.2%～102.1%，表明該方法測定天麻非揮發(fā)性有機酸具有較好的回收率，可用于天麻樣品非揮發(fā)性有機酸的定量分析。

2.4 天麻樣品中6種非揮發(fā)性有機酸的含量

從表3可知，天麻中含有豐富的非揮發(fā)性有機酸，其中蘋果酸的含量最高，平均值為5.00 mg/g，其次是檸檬酸含量，平均值為3.47 mg/g，油酸的含量最低，平均值為0.13 mg/g。云南昭通天麻與湖北宜昌、陜西漢中的相比，檸檬酸含量較高，表明昭通天麻中有效成分較其他地區(qū)好。

表3 天麻樣品中非揮發(fā)性有機酸的含量

3 結論與討論

建立了衍生化GC-MS法快速定量測定天麻中非揮發(fā)性有機酸含量的方法，優(yōu)化的前處理條件為10%硫酸+5% PTSA的甲醇溶液，酯化溫度為50℃，酯化時間為45min，酯化完后采用超聲萃取10 min。方法評價結果顯示，6種非揮發(fā)性有機酸標準曲線的R2均大于0.999 0，檢出限為0.04～2.00 mg/g，6次測定的RSD在1.04%～3.59%，回收率為89.2%～102.1%。天麻中蘋果酸的含量最高，平均為5.00 mg/g；其次是檸檬酸含量，平均為3.47 mg/g；油酸含量最低，平均為0.13 mg/g。云南昭通天麻與湖北宜昌、陜西漢中的相比，檸檬酸含量較高[6]，表明昭通天麻中有效成分較其他地區(qū)的好。

所建立的方法簡便、快速、重現性好，可應用于天麻中非揮發(fā)性有機酸含量測定。由于其他省份天麻樣品數量較少，后續(xù)研究可增加云南省外的天麻樣品的測定數據，再進行對比分析，進而得出更為客觀的對比分析結果。