貴州火龍果采后病害主要病原菌分離鑒定及抑菌植物精油篩選

張綠萍, 袁啟鳳, 解 璞, 王 宇, 王 彬

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹(shù)科學(xué)研究所， 貴州 貴陽(yáng) 550006)

貴州省自2001年引種火龍果，目前已成為全國(guó)主要的火龍果產(chǎn)區(qū)之一，其中貴州羅甸和關(guān)嶺火龍果獲國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品。隨著種植時(shí)間的延長(zhǎng)和種植面積的擴(kuò)大，火龍果栽培上病害發(fā)生日趨嚴(yán)重。而由于采前病菌侵染及采后果實(shí)衰老和抗性下降，病菌從潛伏狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏顟B(tài)而引起果實(shí)發(fā)病腐爛，加重了采后病害的發(fā)生。據(jù)報(bào)道，引起上海市進(jìn)口火龍果軟腐致病真菌主要為尖孢鐮刀菌(FusariumoxysporumSchl.)和單隔鐮刀菌(FusariumdimerumPenzig in Saccardo)[1];海南火龍果采后主要病害有炭疽病〔ColletotrichumgloeosporioidesPenz.和C.capsici (Syd.)Butler & Bisby〕、根霉病〔Rhizopusstolonifer(Ehrenb.exFr.) Vuill.〕、焦腐病(Botryodiplodiatheobromaepat.)、仙人掌平臍蠕孢〔Bipolariscactivora(Petrak) Alcorn〕和革節(jié)孢菌〔Scytalidiumdimidiatum(Penz.) Sutton and Dyko〕，偶見(jiàn)鐮刀菌果腐病(Fusariumsp.)[2];廣西火龍果采后主要病害有木賊鐮刀菌〔Fusariumequiseti(Corda) Sacc.〕、桃吉爾霉〔Gilbertellapersicaria(Eddy) Hesselt.〕、鏈格孢〔Alternariaalternata(Fr.) Keissl.〕、仙人掌平臍蠕孢〔Bipolariscactivora(Petrak)Alcorn〕、新暗色柱節(jié)孢〔Neoscytalidiumdimidiatum(penz.) Crous et Slippers〕[3];云南火龍果采后果腐病主要有科桃吉爾霉(Gilbertellapersicaria)[4]；浙江紅肉火龍果采后貯藏期腐爛病主要有層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum)和平頭炭疽菌(Colletotrichumfructicola)[5]。貴州作為全國(guó)最大的河谷火龍果產(chǎn)地和全國(guó)優(yōu)質(zhì)火龍果的主要輸出地，調(diào)查貴州火龍果的采后病害的種類和發(fā)生情況，以及研究其綠色防治方法，對(duì)減少采后損失，延長(zhǎng)貨架期極為重要。因此，以貴州羅甸、關(guān)嶺、鎮(zhèn)寧采摘的火龍果為研究對(duì)象，應(yīng)用分離培養(yǎng)、柯赫氏法則、形態(tài)學(xué)觀察、rDNA-ITS序列分析、分離鑒定病原菌；并篩選抑制火龍果采后病害適宜的精油種類及濃度，以期為火龍果采后健康環(huán)保的防腐保鮮措施和新型保鮮劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 果實(shí) 火龍果品種為紫紅龍和晶紅龍，2013-2015年從貴州羅甸、鎮(zhèn)寧采收，果皮表面無(wú)病害、無(wú)機(jī)械損傷?；瘕埞謩e進(jìn)行5～6℃冷藏或室溫貯藏，冷庫(kù)冷藏于15 d、20 d、25 d后觀察采后病害發(fā)生情況，室溫貯藏分別于采后5 d、7 d、9 d觀察采后病害發(fā)生情況。

1.1.2 試劑 肉桂精油、生姜精油、桔子精油、丁香葉精油、丁蕾精油、羅勒精油、香根精油均為單方精油，工業(yè)生產(chǎn)，購(gòu)于國(guó)際香精香料公司，玻璃瓶封裝，4℃冰箱貯藏。培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)：馬鈴薯浸汁200 mL；葡萄糖20 g，瓊脂20 g，121℃滅菌20 min。

1.2 病原菌的分離及形態(tài)學(xué)鑒定

采用組織分離法對(duì)發(fā)病火龍果的病原菌進(jìn)行分離純化[6]，將純化后的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)，觀察菌落特征，在顯微鏡下觀察菌絲體形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)、顏色、大小等特征，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3 致病性測(cè)定

根據(jù)柯赫法則進(jìn)行致病性檢測(cè)。挑選健康的火龍果果實(shí)，先用清水清洗晾干，再用75%酒精對(duì)果實(shí)表面消毒，最后用無(wú)菌水沖洗3遍，晾干后備用。將從病果組織中分離純化獲得的真菌接種至PDA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3～5 d備用。無(wú)傷接種：用無(wú)菌打孔器取直徑6 mm的菌落塊接種到果實(shí)赤道部位；有傷接種：用接種針在果實(shí)赤道部位刺傷(直徑約5 mm，深度約5 mm)，接種105CFU/mL的待測(cè)菌孢子懸浮液10 μL，置于溫度28℃，相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每處理果實(shí)5個(gè)，重復(fù)3次，定期觀察發(fā)病情況，顯現(xiàn)病癥后再次分離鑒定。將分離出的菌株與所接菌株的菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)、孢子形態(tài)等進(jìn)行比較，并判斷是否一致。

1.4 植物精油對(duì)病原菌的抑制效果

選擇已有報(bào)道的對(duì)果蔬病原菌有較好抑制效果的肉桂、羅勒、姜油、丁香葉、桔子、丁蕾、香根等7種精油，采用熏蒸法研究其對(duì)貴州火龍果提純分離的致病微生物的抑制效果。

1.4.1 體外抑制試驗(yàn) 將融化的PDA培養(yǎng)基倒入到平板培養(yǎng)皿中，每個(gè)15 mL。用無(wú)菌的打孔器在病原菌(培養(yǎng)7 d)平板上打取直徑為6 mm菌塊放入平板中央，將平板倒置，取一片無(wú)菌直徑為1 cm的濾紙置于平板蓋子中央，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用移液槍取肉桂精油2 μL、4 μL、8 μL滴于濾紙上，其他精油用移液槍取4 μL、8 μL、12 μL分別滴于濾紙上。以濾紙片不添加植物精油的平板為對(duì)照。將平板密封，放入28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后觀察抑菌效果。“十字”法測(cè)量菌落縱橫徑，計(jì)算抑制率，每個(gè)濃度梯度3個(gè)平板，試驗(yàn)重復(fù)3次。

抑制率=(C-T)/C×100%

式中，C為對(duì)照菌落面積，T為不同濃度條件下菌落面積。

1.4.2 活體抑制試驗(yàn) 火龍果用 75%酒精進(jìn)行表面消毒，晾干后，進(jìn)行有傷接種和無(wú)傷接種。有傷接種：接種4個(gè)果，重復(fù)3 次，用接種針刺傷果皮，在傷口注射配制好的仙人掌平臍蠕孢、鏈格孢、桃吉爾霉、層生鐮刀菌、尖孢鐮刀菌5種孢子懸浮液5 μL，然后用體外抑制試驗(yàn)中抑制效果較好的精油20 μL/L進(jìn)行密閉熏蒸處理，室溫貯藏4 d后用軟尺測(cè)量病斑大小。無(wú)傷接種：接種30個(gè)果，在果實(shí)表面分別噴灑配制好的孢子懸浮液，用20 μL/L抑制效果較好的精油進(jìn)行密閉熏蒸處理，室溫貯藏7 d后觀察火龍果腐爛情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病情況

貴州火龍果采收后由于生理、病理、物理以及三者協(xié)同作用引起腐爛，表面著生大量微生物，主要病害為黑斑病和軟腐病(圖1)。

圖1 火龍果貯藏期主要病害癥狀

2.2 病原菌分離純化及鑒定結(jié)果

從火龍果發(fā)病部位共分離得到8株真菌，5株具有致病能力，產(chǎn)生典型病害癥狀，分別標(biāo)記為HS1、HS2、HS3、HS4、HS5。其中HS3能使無(wú)傷果發(fā)病，且發(fā)病迅速，感染后3 d全果果皮腐爛，呈水浸狀。另外4菌株可使傷果發(fā)病，先褪色凹陷，然后在病斑處生長(zhǎng)接種菌絲。

2.2.1 病原菌HS1 致病菌HS1在PDA培養(yǎng)基上菌落為圓形，絨毛狀，邊緣整齊，氣生菌絲白色，成熟后變?yōu)榘稻G(圖2-1)。分生孢子梗叢生或散生，分枝有隔，頂部常見(jiàn)分支或合軸式延伸，褐色。分生孢子褐色，橢圓形或倒棍棒狀，表面光滑，具1～4個(gè)假隔膜，多數(shù)為2～3個(gè)假隔膜(圖2-2)?；亟? d，接種處呈擴(kuò)大凹陷、周圍約2 cm的圓形褪色病斑(圖2-3)；接種5 d病斑略為擴(kuò)大，軟腐，水浸狀，感病中心著生大量絨毛狀菌絲，外觀形態(tài)與PDA培養(yǎng)基相似(圖2-4)。參照李敏[2-3，7]特征描述，以及通過(guò)與真菌鑒定手冊(cè)的形態(tài)對(duì)比，HS1病原菌鑒定為仙人掌平臍蠕孢〔Bipolariscactivora(Petrak) Alcorn〕。

2.2.2 病原菌HS2 HS2病原菌在PDA培養(yǎng)基菌落呈圓形，初期菌絲灰白色，后變?yōu)榛揖G色，培養(yǎng)基底面為黑色(圖3-1)。分生孢子梗直立、分枝或不分枝，淡褐色；分生孢子褐色或深褐色，呈梨形或橢圓形、卵形，形狀變化較大表面光滑或有瘤(圖3-2)?；亟? d，接種周圍約0.5 cm的圓形褪色；接種5 d病斑呈圓形擴(kuò)大，軟腐，水浸狀，感病中心著生灰白色絨毛狀菌絲，外觀形態(tài)與PDA培養(yǎng)基初生菌絲相似(圖3-3、3-4)。參照林珊宇等[3，8-9]的特征描述，以及與真菌鑒定手冊(cè)的形態(tài)對(duì)比，HS2病原菌鑒定為鏈格孢〔Alternariaalternata(Fr.) Keissl.〕。

2.2.3 病原菌HS3 HS3病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)3 d即布滿直徑為9 cm的培養(yǎng)皿,菌落無(wú)色，有大量黑色點(diǎn)狀孢子囊(圖4-1);分生孢子梗透明，無(wú)隔無(wú)分枝，頂部有圓形孢子囊(圖4-2)?；亟? d，病斑呈水浸狀擴(kuò)大、無(wú)凹陷，病斑大小約2 cm×3 cm，接種5 d整個(gè)果實(shí)呈水浸狀腐爛，著生與PDA培養(yǎng)相似的菌絲(圖4-3、4-4)。參照林珊宇等[3-4]的特征描述以及與真菌鑒定手冊(cè)的形態(tài)對(duì)比，HS3病原菌鑒定為桃吉爾霉(Gilbertellapersicaria)。

圖2 HS1菌落形態(tài)、菌絲及分生孢子形態(tài)、回接2 d和5 d的致病癥狀

圖3 HS2菌落形態(tài)、菌絲及分生孢子、回接2 d和5 d的致病癥狀

圖4 HS3菌落形態(tài)、菌絲及分生孢子、回接2 d和5 d的致病癥狀

2.2.4 病原菌HS4和HS5 致病菌HS4、HS5在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度相似，且均為絨狀、棉絮狀白色菌絲，HS4較為致密(圖5-1)，菌絲背面為淡黃色，在PDA培養(yǎng)基中分泌出淡黃色和紅黃色色素(圖5-2)。HS4的分生孢子梗為藍(lán)綠色，著生菌絲呈短小爪狀，透明有隔。分生孢子藍(lán)色，呈長(zhǎng)橢圓形或新月形，多數(shù)2～3個(gè)隔膜(圖 5-3) ?；亟? d，接種處褪色，著生白色棉絮狀菌絲(圖5-4)；接種5 d，形成黃褐色、凹陷且邊緣清晰，著生白色致密絨狀微生物的病斑，病斑約2 cm×3 cm大小，其感病中心菌絲外觀形態(tài)與PDA培養(yǎng)基相似(圖5-5)。HS5較為疏松(圖6-1),在培養(yǎng)基中分泌黃色至橘黃色色素(圖6-1)，分生孢子淡藍(lán)色，鐮刀形，具3～5隔(圖6-2)?；亟? d，接種處呈擴(kuò)大凹陷、形成約1 cm凹陷、軟腐圓形褐色病斑，中間著生白色菌絲(圖6-3)，接種5 d病斑約為直徑2 cm軟腐(圖6-4)，感病中心菌絲外觀形態(tài)與PDA培養(yǎng)基相似。參照崔志婧等[1，3，5]的特征描述，以及與真菌鑒定手冊(cè)的形態(tài)對(duì)比，將HS4、HS5病原菌初步鑒定鐮刀菌(Fusarium)。

為進(jìn)一步鑒定HS4和HS5，利用PCR方法對(duì)病原菌基因組DNA進(jìn)行ITS鑒定。真菌HS4的rDNA序列擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)blast比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析(圖7)，HS4與層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum,登錄號(hào)636868)的ITS序列100%同源，HS5與尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum,登錄號(hào)MN181571)ITS序列的同源性為100%。

圖5 HS4菌落正面和反面形態(tài)、菌絲及分生孢子、回接2 d和5 d的致病癥狀

Fig.5 Morphology of HS4 positive and negative forms of colony, morphology of mycelia and conidia,and pathogenic symptoms of 2 d and 5 d grafting

圖6 HS5菌落形態(tài)、菌絲及分生孢子、回接2 d和5 d的致病癥狀

Fig.6 Morphology of HS5 colony, morphology of mycelia and conidia, and pathogenic symptoms of 2 d and 5 d grafting

圖7真菌HS4和HS5的分子系統(tǒng)樹(shù)

Fig.7 Molecular tree of fungal HS4 and HS5

2.3 植物精油對(duì)火龍果致病真菌的抑菌效果

2.3.1 體外抑菌效果 從表1看出，隨著精油添加量的增加，其抑菌效果也增加。對(duì)5種病原菌的抑制效果以肉桂精油的最佳，當(dāng)精油添加量為6 μL時(shí)，對(duì)HS1、HS2、HS4、HS5的抑制率均達(dá)100%。其次是羅勒和丁香葉精油，精油添加置為12 μL時(shí)，對(duì)HS1、HS2、HS4和HS5的抑制率在80%以上；香根的抑制效果也較好，抑制率在80%左右；姜油和丁蕾對(duì)病原菌有一定的抑制效果，抑制率在60%左右；桔子精油對(duì)病原菌的抑制效果最差，抑制率低于50%。肉桂精油對(duì)HS3有抑制作用，在精油添加量為6 μL時(shí)，抑制率達(dá)96.71%；羅勒、丁香葉和姜油精油對(duì)HS3病原菌的有一定的抑制效果，但效果相對(duì)較差，在精油添加量為12 μL時(shí)抑制率分別為31.48%、29.14和3.96；桔子、丁蕾和香根精油對(duì)HS3病原菌無(wú)抑制效果。

表1 不同精油對(duì)火龍果采后主要病原菌的體外抑菌率

2.4 體內(nèi)抑菌效果

將對(duì)各病原菌抑制效果較好的肉桂精油熏蒸無(wú)傷接種和有傷接種的果實(shí)，結(jié)果表明(表2)，肉桂精油熏蒸處理能抑制無(wú)傷接種的腐爛率，腐爛率與對(duì)照均呈顯著差異；減緩有傷接種病斑的擴(kuò)大速度，病斑大小與對(duì)照呈顯著差異。HS3的致病性最強(qiáng)，有傷接種3 d，果皮50%面積出現(xiàn)水浸狀病斑，接種5 d全果腐爛；無(wú)傷接種4 d，50%以上果實(shí)表皮出現(xiàn)水浸狀病斑。此外，精油直接接觸果皮會(huì)造成藥害。

表2 肉桂精油熏蒸接種致病菌火龍果的腐爛率及病斑大小

注：不同字母表示差異顯著(P≤0.05)；有傷接種的腐爛率為100%，無(wú)傷接種的病斑不一定在接種點(diǎn)，因此沒(méi)有測(cè)量。

Note: Different letters mean significant difference (P≤0.05). The decay rate of inoculation with wound was 100%, and the lesion without wound inoculation was not necessarily at the inoculation site, so no measurement was made.

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果初步確定貴州火龍果采后主要病害致病菌為仙人掌平臍蠕孢、鏈格孢、桃吉爾霉、層生鐮刀菌和尖鐮刀菌，與廣東[7]、廣西[3]、海南[2]、云南[4]、浙江[5]等產(chǎn)區(qū)及上海市[1]進(jìn)口火龍果的文獻(xiàn)報(bào)道有部分相似之處，也與朱迎迎等[10]統(tǒng)計(jì)的引起在我國(guó)火龍果釆后病害的真菌相符。另外，研究首次從同一軟腐病組織中分離層生鐮刀菌和尖孢鐮刀菌2種鐮刀菌。

精油是存在于植物體內(nèi)的一類可隨水蒸氣蒸餾且具有一定氣味的揮發(fā)性油狀液體的總稱[11]。精油及其成分具有明顯的抑菌作用，其低毒且對(duì)環(huán)境影響小，可作為傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑的替代物用于果蔬貯藏保鮮[12]。植物精油作為植物源熏蒸類抑菌劑，已經(jīng)用于多種果蔬采后病害控制的研究[13-15]。肉桂精油經(jīng)美國(guó)食品香料和萃取物制造者協(xié)會(huì)(food spices and extract manufacturers associa-tion, FEMA)認(rèn)證可作為食品香料使用，并獲得美國(guó)食品藥物管理局(food and drug administration, FDA)批準(zhǔn)，F(xiàn)EMA號(hào)為2258，且已被納入中國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》GB 2760-2014，進(jìn)入允許使用的食品用天然香料名單，編碼為039。目前，肉桂精油在水果貯藏保鮮方面的應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)[16-19]。試驗(yàn)結(jié)果表明：7種植物精油中，對(duì)貴州火龍果采后5種致病菌的抑菌效果最好的是肉桂精油，其能有效降低腐爛率，減緩傷口病斑的擴(kuò)增，試驗(yàn)結(jié)果與劉瑞玲等[5]的肉桂精油對(duì)浙江產(chǎn)區(qū)火龍果采后主要致病菌層生鐮刀菌的抑制作用相一致。

研究結(jié)果可為貴州火龍果采后病害發(fā)生規(guī)律研究及進(jìn)一步制定切實(shí)有效的采后病害綜合防治措施提供參考和依據(jù)。同時(shí)，根據(jù)精油的體內(nèi)抑菌和體外抑菌效果，肉桂精油作為火龍果貯藏前及貯藏期熏蒸殺菌劑具有較好的應(yīng)用前景，但生產(chǎn)上應(yīng)用的最適宜濃度，避免藥害及有效熏蒸的放置點(diǎn)等參數(shù)還有待于進(jìn)一步探索。