5種水生植物對銅綠微囊藻的抑制與生理影響研究

賈惠雁，陳永華，陳明利，杜露，韓良澤，柳俊

（中南林業(yè)科技大學環(huán)境科學與工程學院，湖南 長沙 410004）

近年來水體富營養(yǎng)化狀況日趨嚴峻，水華藻類泛濫，引發(fā)了一系列環(huán)境問題[1]。國內外已經研究了各種控藻技術，主要包括水文法、化學法、物理法、物理化學法、生物生態(tài)法等，其中物理法和化學法雖處理效率較高，但存在成本昂貴或破壞生態(tài)等弊端[2]。近年來，有研究者們發(fā)現很多水生植物可通過自身組織所分泌的化感物質對其他植物、藻類、微生物的生長產生干擾，并且化感物質作為生物的二次代謝產物，具有易降解，毒副作用低等優(yōu)勢，因此，作為一種較安全的生態(tài)控藻技術被廣為研究和嘗試[3]。同時，由于水華藻類與水生植物生長環(huán)境的特殊性和同一性，水生植物所產生的化感物質更容易外滲、擴散至水環(huán)境中，并且直接作用于目標浮游藻類[4]，因此，水生植物化感抑藻效應的研究價值極高。

Hasler[5]在1949年首次發(fā)現了水生植物可通過化感效應，對浮游藻類的生長產生抑制作用，之后大量具有抑藻作用的水生植物以及水生植物中的抑藻活性組分不斷被研究者們證實和挖掘。張勝娟[6]發(fā)現槐葉萍養(yǎng)殖水對銅綠微囊藻的生長具有極強的抑制作用，抑藻率最高可達100%。李磊和侯文華[7]比較了荷花及睡蓮種植水對銅綠微囊藻的抑制作用，發(fā)現睡蓮種植水的抑藻效果相對更好，最高抑藻率可達80%左右。黃新穎等[8]發(fā)現馬來眼子菜、黑藻和苦草種植水對銅綠微囊藻具有明顯的抑制效果，并從種植水中分離得到了亞麻酸、對羥基苯甲酸、反式阿魏酸等8種化感物質。張勝花[9]的試驗表明，黃絲草種植水對銅綠微囊藻株的抑制作用強于馬來眼子菜，并從黃絲草中提取得到了棕櫚酸、生物堿、植物醇等具有抑藻效應的化合物。研究證實，水生植物所釋放的化感物質主要通過破壞水華藻類的細胞膜、改變其正常的酶活性、影響其光合能力等多種生理途徑來抑制水華藻類的生長，如鳳眼蓮、美人蕉、慈姑等可以通過自身根系、球莖等組織產生的化感物質來破壞銅綠微囊藻的抗氧化系統(tǒng)，顯著抑制其生長[10-12]。

以往關于水生植物化感抑藻的研究中，較少系統(tǒng)地比較幾種不同類型的水生植物在藻類抑制方面的能力，尤其是水蕹菜，其在富營養(yǎng)化水體治理技術中應用最多[13-14]，目前關于其抑藻方面的報道卻十分鮮見。因此本研究選擇了挺水植物菖蒲、沉水植物黑藻及苦草、浮水植物綠狐尾藻及水蕹菜5種水質凈化能力強的水生植物為研究材料，以常見水華藻—銅綠微囊藻作為對象藻種，進行植物化感抑藻能力的比較研究，并從藻抗氧化體系反應、膜透性改變以及光合能力變化角度，初步分析了抑藻能力最佳的種植水對銅綠微囊藻的生理影響，以期為有害藻種的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗藻種：銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa，FACHB-905）購自中國科學院武漢水生生物研究所淡水藻種庫，采用BG-11培養(yǎng)基[15]于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：光照強度2000 lux，光暗比為12 h∶12 h，溫度（25±1） ℃，每天搖晃3次并隨機變換空間位置，待進入對數生長期，即用于試驗。

水生植物種植水：5種水生植物見表1，均于春季（5月）采自湖南省株洲市攸縣酒埠江鎮(zhèn)安橋村種植基地。試驗前洗凈表面附著的雜質，并用超純水潤洗3遍，吸干表面水分后，分別稱取100 g，移植于底部鋪有厚約5 cm干凈細沙的塑料桶中，桶內裝2 L超純水，于室溫（25±1）℃、自然光照的窗邊培養(yǎng)20 d后，移走植物，種植水用中速濾紙過濾一遍，再經0.45 μm微孔濾膜減壓真空抽濾，取50 g/L試驗種植水用于試驗。

表1 試驗水生植物品種Table 1 Varieties of experimental aquatic plant

1.2 試驗方法

1.2.1 種植水抑藻能力比較試驗 用5種水生植物種植水分別代替超純水，配置BG-11培養(yǎng)基（0.12MPa、121 ℃滅菌20 min），種植水僅抽濾不滅菌，分別配置為0%（對照組）、20%、60%、80%、100%五個濃度梯度，即每組種植水培養(yǎng)基中種植水質量濃度分別為0 g/L（對照組）、10 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L，每個濃度組分別設置三個平行，每組營養(yǎng)成分及濃度一致，并用0.1 mol/L NaHCO3或0.1 mol/L HCl將每組培養(yǎng)液的pH調節(jié)至7～8，在無菌條件下接種處于對數生長期的銅綠微囊藻于100 mL種植水培養(yǎng)基中。初始光密度值（OD680）為0.1，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光照強度2000 lux，光暗比為12 h∶12 h，溫度（25±1）℃，每天搖晃2～3次并隨機變換空間位置。每隔48 h定時定量取藻液記錄光密度（OD680），并計算抑制率，連續(xù)記錄5次，共11 d。

1.2.2 種植水對銅綠微囊藻的生理影響試驗 根據抑藻試驗結果，選定抑藻效果最佳的種植水代替超純水，配置種植水濃度為40 g/L的BG-11培養(yǎng)基（0.12MPa、121 ℃滅菌20 min，），種植水僅抽濾不滅菌，另設一個對照組，每組設置三個平行，每組營養(yǎng)成分及濃度一致。在無菌條件下，接種處于對數生長期的銅綠微囊藻于100 mL種植水培養(yǎng)基中，初始光密度值（OD680）為0.1。每隔48 h定時定量取藻液，測定超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量、非電解質外滲量、核酸滲出量、葉綠素a含量，連續(xù)測定6次，共11 d。分析銅綠微囊藻抗氧化系統(tǒng)、細胞膜透性、光合能力的變化。

1.3 測定方法

1.3.1 銅綠微囊藻生物量測定 以紫外可見分光光度計下波長680 nm處吸光度值（OD680）表示藻細胞光密度，銅綠微囊藻的抑制率計算見公式（1）[16]：

式中：IR表示抑制率，N表示處理組的藻OD680值，N0表示對照組的藻OD680值。

1.3.2 抗氧化體系指標的測定 藻細胞粗酶液采用玻璃勻漿器勻漿法[17]提?。涸逡河? 000 rpm下離心10 min，得藻細胞沉淀；用等滲磷酸鹽緩沖溶液懸浮藻沉淀，在盛有冰水的器皿中用玻璃勻漿管使藻細胞勻漿化，勻漿后的樣本離心10 min，上清液即藻粗酶液。藻細胞過氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量均采用試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）測定。

1.3.3 銅綠微囊藻細胞膜透性的測定 核酸滲出量：以紫外可見分光光度計下波長260 nm處吸光度值（OD260）估計藻細胞核酸釋放量[18]。非電解質外滲量：以紫外可見分光光度計下264 nm處吸光度值（OD264值）估計藻細胞非電解質外滲量[19]。

1.3.4 銅綠微囊藻葉綠素a的測定 采用90%丙酮溶液提取、分離藻細胞葉綠素a[20]，用三色法測定[21]。葉綠素a含量計算見公式（2）：

式中：Chl-a表示葉綠素a的濃度，mg/L；OD663、OD645、OD630分別表示紫外可見分光光度計下663 nm、645 nm、630 nm波長處吸光度值。

1.4 數據處理

本試驗所列數據均為平均值±標準差，采用SPSS 22.0中Duncan多重比較法進行統(tǒng)計分析，數據圖表均在Excel 2016及Origin 2017軟件中處理繪制。

2 結果與分析

2.1 5種水生植物對銅綠微囊藻的抑制能力

從5種水生植物種植水的平均抑藻率（表2）可知，5種植物種植水均對銅綠微囊藻產生了一定的抑制作用，每種植物種植水的抑制作用均表現出隨濃度升高而增強的現象。其中在高濃度50 g/L下，5種種植水均達到最佳的抑藻效果，其中沉水植物苦草和浮水植物水蕹菜抑制效果最好，10 d內平均抑制率分別可達90.30%和86.05%；其次為沉水植物黑藻和浮水植物綠狐尾藻，平均抑制率為76.54%和59.12%；挺水植物菖蒲抑制效果最弱，平均抑制率僅為34.44%。這表明在同樣的處理濃度下，沉水植物和浮水植物的抑藻效果優(yōu)于挺水植物。

表2 5種水生植物種植水的平均抑藻率（%）Table 2 Average inhibition ratio of five aquatic filtrates on Microcystis aeruginosa (%)

從5種水生植物種植水對銅綠微囊藻的抑制率動態(tài)變化（圖1）可知，種植水的抑藻效果受濃度及時間變化影響較大。在高濃度50 g/L下，黑藻、苦草、水蕹菜種植水對銅綠微囊藻的抑制效果較好，最高抑制率均可達到85%以上，其次為綠狐尾藻，最高抑制率為68.26 %，菖蒲種植水的抑制效果相對最差，最高抑制率僅為53.53%；在40 g/L濃度下，綠狐尾藻種植水的抑制率下降最明顯，在第10 d時抑制率下降至負值，促進了銅綠微囊藻的生長，說明綠狐尾藻種植水的化感抑藻作用受濃度影響極大；對于10 g/L和30 g/L的低濃度處理組，5種種植水的抑制率普遍低于高濃度組，且在后期出現了較明顯的下降，菖蒲和綠狐尾藻組甚至在第8 d后抑制率為負，說明種植水對藻細胞的抑制作用是由植物所分泌的化感物質濃度決定的，在較低濃度下對藻細胞的抑制效果相對較差且不持久，隨著種植水中化感物質的消耗，在極低濃度下，反而促進了藻細胞的生長。

綜上，銅綠微囊藻細胞被影響的情況與種植水中化感物質的濃度緊密相關。從抑制率以及持久性來看，沉水植物苦草與浮水植物水蕹菜對銅綠微囊藻生長的抑制效果最佳。

圖1 5種水生植物種植水對銅綠微囊藻的抑制率動態(tài)變化Fig. 1 Dynamic Changes of inhibition ratio of five aquatic filtrates on Microcystis aeruginosa

2.2 苦草和水蕹菜種植水對銅綠微囊藻抗氧化體系的影響

以較高濃度40 g/L苦草及水蕹菜種植水為例，研究種植水對銅綠微囊藻抗氧化體系的影響（圖2）可知，藻細胞在種植水的作用下，SOD、POD、CAT活性于第2～4 d達到高峰，然后逐漸降低。這表明種植水可能存在某些化感物質，對銅綠微囊藻產生了脅迫，導致藻細胞生成了活性氧等對自身生長有害的物質，從而相關抗氧化酶活性升高，以平衡活性氧等物質來減輕環(huán)境脅迫所造成的機體傷害。但當活性氧物質過量時，將會破壞抗氧化酶的平衡功能，導致酶活性降低。在40 g/L種植水處理下，苦草組的藻細胞于第4 d時SOD、POD、CAT活性升至峰值，分別為914.74 U/mg、149.23 U/mg、131.8 U/mg，相比對照組高出了2倍左右（P＜0.05），但峰值過后，苦草組的藻細胞三種酶活性逐漸降低至對照組水平。這表明苦草組的藻細胞抗氧化酶未達到功能極限，隨著培養(yǎng)時間延長，種植水中化感物質濃度降低，藻細胞受到的脅迫作用隨之減弱，酶活性恢復正常。水蕹菜組的藻細胞于第2 d時SOD、POD、CAT活性升至峰值，分別為976.42 U/mg、165.02 U/mg、142.49 U/mg，相比對照組顯著高出2～3倍（P＜0.05），但是在第10 d時SOD、POD、CAT活性分別僅有96.24 U/mg、20.14 U/mg、19.89 U/mg，顯著低于對照組（P＜0.05），此時表明水蕹菜種植水可能使藻細胞抗氧化酶達到了處理極限，活性氧等物質過量積累，打破了抗氧化系統(tǒng)動態(tài)平衡，最終導致抗氧化酶基本失活。

由銅綠微囊藻丙二醛（MDA）含量的變化（圖2）可知，各處理組MDA含量與抗氧化酶變化趨勢一致，均呈先升至峰值后降低，這可能是在化感物質的作用下，藻細胞受到了一定程度的膜脂過氧化損傷，但水蕹菜組的藻細胞MDA峰值為8.31 nmol/mg，高于苦草組峰值，這也說明了水蕹菜種植水對藻細胞產生的膜脂過氧化損傷更嚴重。

圖2 苦草及水蕹菜種植水對銅綠微囊藻抗氧化體系的影響Fig. 2 The effects of filtrates of Vallisneria natans and Ipomoea aquatica Forsk on antioxidant system of Microcystis aeruginosa

2.3 苦草和水蕹菜種植水對銅綠微囊藻膜透性的影響

由苦草及水蕹菜種植水對銅綠微囊藻細胞膜透性的影響（圖3）可知，從第0 d開始，處理組的核酸滲出量及非電解質外滲量開始顯著高于對照組（P＜0.05），說明試驗前期處理組的藻細胞膜已經與種植水中化感物質進行了接觸，并受到其強烈的刺激和破壞，胞內核酸及非電解質物質外滲，導致OD264和OD260值升高。整體來說，水蕹菜組藻細胞胞內物質的外滲量高于苦草組，這也反映了水蕹菜組的藻細胞相對來說受損更嚴重，這與前面種植水對藻的抑制率結果規(guī)律一致。

2.4 苦草和水蕹菜種植水對銅綠微囊藻葉綠素a的影響

由苦草及水蕹菜種植水對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響（表3）可知，在2種種植水分別作用下，銅綠微囊藻的葉綠素a含量出現了不同程度的降低。水蕹菜組的藻葉綠素a從0.051 mg/L開始下降，至第10 d時僅為0.020 mg/L，此時藻液澄清，藻細胞基本被殺死；苦草組的藻葉綠素a在第2 d時明顯降低，僅為0.042 mg/L，藻細胞的生長被明顯抑制，但第4 d后藻葉綠素a出現了輕微的增長現象，這可能是因為苦草種植水中的化感物質對藻光合能力破壞不徹底，隨著時間的延長，化感物質濃度降低，對銅綠微囊藻影響減弱，使其逐漸適應了苦草種植水環(huán)境，這與前面種植水對藻的抑制率結果規(guī)律一致。

圖3 苦草及水蕹菜種植水對銅綠微囊藻細胞膜透性的影響Fig. 3 The effects of filtrates of Vallisneria natans and Ipomoea aquatica Forsk on cell membrane permeability of Microcystis aeruginosa

表3 苦草及水蕹菜種植水對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響（mg/L）Table 3 The effects of filtrates of Vallisneria natans and Ipomoea aquatica Forsk on the chlorophyll-a content of Microcystis aeruginosa（mg/L）

3 討論

3.1 5種水生植物抑藻能力研究

通過研究菖蒲、黑藻、苦草、綠狐尾藻以及水蕹菜種植水的抑藻能力，可以發(fā)現，在培養(yǎng)基及環(huán)境因素等其他試驗條件一致的情況下，5種種植水均對銅綠微囊藻的生長產生了一定的抑制作用，這可能是由于它們通過自身組織，釋放了一定量的化感物質進入水體，這些化感物質抑制了藻細胞的生長[22]。從植物種類來看，沉水植物和浮水植物的抑藻效果優(yōu)于挺水植物，這可能是由于沉水植物和浮水植物與水體接觸面積大有一定關系[23]。從種植水濃度觀察，植物種植水的低濃度組與高濃度組相比，抑制率普遍較低。另外，隨著時間的延長，較低濃度組的抑制率在后期基本出現了降低現象，而菖蒲、綠狐尾藻的較低濃度組甚至在后期促進了藻細胞生長。這可能是由于植物自然分泌進入水體的化感物質本身較為分散、并且二次代謝產物大多具有不穩(wěn)定性，在化感作用消耗以及自然降解的雙重作用下，化感物質濃度迅速降低[24]，導致抑制效果減弱，當種植水中某些抑藻活性組分的濃度低于某一閾值時，無法使銅綠微囊藻完全失活，反而刺激其生長。一方面為了應對環(huán)境脅迫，導致藻細胞主動調節(jié)自身生理保護機制，比如提高相關酶的活性，以加速獲取環(huán)境中的營養(yǎng)成分、光能或掃除自身生成的有害物質[25]；另一方面，可能是化感物質在一定的濃度內，可以與藻細胞內興奮性受體結合，發(fā)生了興奮性反應，從而使藻細胞生長得到了促進[26]。這與前人研究睡蓮種植水抑藻過程中所出現的“低促高抑”現象一致[7]。由此說明，水生植物連續(xù)、持久地釋放化感物質是其穩(wěn)定發(fā)揮抑藻能力的關鍵。

3.2 苦草和水蕹菜種植水對銅綠微囊藻抗氧化體系的影響

抗氧化體系是生物體面對外界環(huán)境有害脅迫時的重要防御機制之一，其相關抗氧化酶活性的變化，反映了生物體所受到的外界環(huán)境脅迫的程度[27-28]。趙坤[29]利用水網藻種植水培養(yǎng)銅綠微囊藻時，藻細胞SOD活性出現了劇烈升高，達到峰值后下降至徹底失活的現象。本試驗中，銅綠微囊藻在40 g/L苦草及水蕹菜種植水的作用下，藻細胞的SOD、POD、CAT活性與MDA變化趨勢大體一致，均呈先升至峰值后降低。這表明苦草及水蕹菜種植水環(huán)境對銅綠微囊藻的生長產生了脅迫，導致其細胞膜發(fā)生了膜脂過氧化作用，生成了膜脂過氧化產物[30-31]，同時誘導藻細胞生成了對自身生長有害的活性氧等物質?？寡趸w系中的酶開始為掃除這些物質而發(fā)揮作用，比如SOD作為首要加工酶在掃除O2-的同時，會迅速轉化為H2O2，與此同時POD與CAT聯合，利用SOD加工后的產物H2O2為電子受體，催化有害于機體的其他物質氧化，因此三種酶的活性在種植水環(huán)境的脅迫下出現了劇烈升高[32]。在試驗后期，苦草組的藻細胞SOD、POD、CAT活性恢復正常，而水蕹菜組的藻細胞SOD、POD、CAT卻完全失活，這可能是因為苦草種植水中某些針對銅綠微囊藻作用的靶類物質，在40 g/L濃度下未能使藻細胞抗氧化酶達到功能極限，隨著化感物質濃度降低，藻細胞受到的脅迫作用隨之減弱，酶活性逐漸恢復正常。而水蕹菜種植水中的化感物質在相同濃度下，導致藻細胞達到了自身抗氧化體系的處理極限，使其無法繼續(xù)平衡生理損傷，破壞了細胞正常代謝，最終抗氧化酶喪失活性?？嗖菁八巢朔N植水對藻細胞酶活性所產生的不同結果，也反映了化感作用具有明顯的濃度效應，不同的化感物質發(fā)揮作用的濃度范圍不相同[33]。

3.3 苦草和水蕹菜種植水對銅綠微囊藻膜透性的影響

細胞膜是生物體抵御外界環(huán)境變化以及選擇性控制胞內外物質交換的第一道屏障，通常也是化感抑藻物質對銅綠微囊藻發(fā)揮作用的初始位點[34]。戴立洲和成小英[35]研究豆瓣菜干粉對銅綠微囊藻的生理脅迫時發(fā)現，化感作用使藻液電導率及核酸相對含量上升，細胞膜系統(tǒng)發(fā)生膜脂過氧化導致其結構嚴重受損，從而引發(fā)胞內DNA、蛋白質、葉綠素等產生異常改變。本試驗中，在培養(yǎng)基及環(huán)境因素等保持一致的情況下，經40 g/L苦草及水蕹菜種植水分別處理后，銅綠微囊藻細胞核酸滲出量及非電解質外滲量一直顯著高于對照組，說明銅綠微囊藻細胞可能與兩種種植水中的化感物質分別進行了接觸，并受到其強烈的刺激，導致藻細胞質膜上某些酶的正?；钚允艿搅擞绊慬36]，抑或是膜電位發(fā)生了不利改變[37]，從而細胞結構受損，正常的選擇透性被破壞。因此細胞外一些對自身有害的物質加速進入細胞內，同時一些胞內物質如核酸、蛋白質、金屬離子以及非電解質等也從胞內外滲[38-39]。從整體來看，水蕹菜組的藻細胞膜結構損傷更嚴重，這也符合銅綠微囊藻的生長狀況。

3.4 苦草和水蕹菜種植水對銅綠微囊藻葉綠素a的影響

銅綠微囊藻是光合自養(yǎng)生物，葉綠素a作為其主要的光合色素，可同化CO2，將光能轉換為用于自身繁殖與生存的能量，因此葉綠素a含量的變化可間接反映出藻生物量的改變[40]。馮彬[41]利用香蒲葉浸提液對銅綠微囊藻及水華魚腥藻作用時發(fā)現，5 g/L的浸提液可促進兩種藻葉綠素a含量的增加，但25 g/L、50 g/L的浸提液可嚴重破壞兩種藻的葉綠素a，導致其生長被顯著抑制。本試驗結果顯示，在培養(yǎng)基及環(huán)境因素等保持一致的情況下，經40 g/L苦草及水蕹菜種植水分別處理后，銅綠微囊藻葉綠素a含量均明顯減少。這一方面可能是由于苦草及水蕹菜種植水中存在某些具有抑藻效應的化感物質，直接阻礙了銅綠微囊藻葉綠素a的合成，或影響了與其合成直接相關的物質的活性，導致葉綠素a的合成受到較大的阻礙[42]。另一方面可能是種植水中的化感物質對銅綠微囊藻細胞中一些具備捕獲光能、傳遞光能、激發(fā)轉換、維護葉綠素a等重要輔助功能團色素如藻藍蛋白、別藻藍蛋白等造成了損傷，從而間接影響了葉綠素a的合成及功能[43]，導致藻細胞光合活性大大降低，影響其正常生長。

4 結論

1）5種水生植物種植水均能對銅綠微囊藻產生化感抑制作用，但在相同濃度下，5種植物種植水所發(fā)揮的化感作用強度不同。在10 g/L和50 g/L濃度下，苦草的平均抑藻率最高；在30 g/L和40 g/L濃度下，水蕹菜的平均抑藻率最高。

2）5種水生植物種植水對銅綠微囊藻的化感作用均隨濃度升高而增強，較低濃度組隨時間延長而抑制作用減弱的現象明顯，因此在水生植物的實際抑藻運用中應考慮化感物質的持續(xù)釋放。

3）40 g/L苦草及水蕹菜種植水均能導致銅綠微囊藻SOD、POD、CAT活性以及MDA含量先升后降，核酸滲出量和非電解質外滲量明顯升高，葉綠素a含量顯著降低。