自噬及其在腎纖維化中的作用研究進(jìn)展

吳承，朱少明綜述 程帆審校

腎纖維化(renal fibrosis)是由各種致病因素導(dǎo)致的腎臟結(jié)構(gòu)進(jìn)行性損壞和功能逐漸喪失的病理生理過程，是所有進(jìn)展性慢性腎病(CKD)發(fā)展為終末期腎病的共同途徑。其特征為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在腎小管間質(zhì)中過度沉積。腎纖維化的發(fā)病機(jī)制是初始損傷后發(fā)生的一種失敗或適應(yīng)不良的腎臟修復(fù)過程，它涉及腎臟中幾乎所有細(xì)胞類型的相互作用和協(xié)調(diào)[1]。腎纖維化是一個很難逆轉(zhuǎn)的病理過程，目前尚無有效的治療方法。自噬(autophagy)是細(xì)胞通過形成自噬體和自噬溶酶體對細(xì)胞質(zhì)組分進(jìn)行降解的過程。自噬除了具有分解代謝功能外，還是細(xì)胞對應(yīng)激的一種適應(yīng)性反應(yīng)和保護(hù)機(jī)制，在各種疾病包括纖維化疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。近年來，多項研究證明自噬在腎纖維化疾病中起作用[2-3]，根據(jù)細(xì)胞或組織類型和病理狀態(tài)，自噬可以促纖維化或抗纖維化[4-5]。這些研究表明誘導(dǎo)自噬可能參與腎纖維化的腎保護(hù)機(jī)制，但其相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制尚未明確。因此，研究自噬及其在腎纖維化中的作用對于尋找腎纖維化的有效治療靶點尤為必要。

1 自噬的概念及分類

自噬指細(xì)胞在各種應(yīng)激條件下，通過形成雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡(即自噬體)，包裹細(xì)胞內(nèi)損傷或變性的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)以及入侵的病原體等物質(zhì)，并運(yùn)送到溶酶體中進(jìn)行降解的生物學(xué)過程。其過程大致分為誘導(dǎo)、核化、自噬前體的延伸、自噬體的成熟等4個階段，它的典型特征是在細(xì)胞質(zhì)中形成自噬體。自噬分為生理條件下的基礎(chǔ)自噬以及應(yīng)激條件下的誘導(dǎo)型自噬[6]。生理狀態(tài)下，細(xì)胞通過自噬降解損傷、變性、衰老和失去功能的細(xì)胞、細(xì)胞器及各種生物大分子，實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的分解代謝和循環(huán)利用。病理狀態(tài)下，自噬作為細(xì)胞的一種保護(hù)機(jī)制可以清除入侵的病原體，并可保護(hù)細(xì)胞免受毒性物質(zhì)的損傷。根據(jù)功能和細(xì)胞內(nèi)底物進(jìn)入溶酶體的途徑不同，又可將自噬分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)、分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)等3種主要類型[7]。巨自噬是研究最為廣泛和深入的類型，通常所說的自噬即指巨自噬。微自噬是指直接通過溶酶體膜隨機(jī)突出和內(nèi)陷吞噬細(xì)胞內(nèi)容物的一種非選擇性降解過程。分子伴侶介導(dǎo)的自噬是由分子伴侶蛋白如熱休克蛋白70(HSP70)識別含有特定序列五肽基的可溶性蛋白底物并與之結(jié)合，然后經(jīng)過單獨(dú)跨膜轉(zhuǎn)移將這些底物運(yùn)送到溶酶體內(nèi)降解，但不能降解細(xì)胞器，此類型自噬只存在于哺乳動物細(xì)胞中，而且具有高度選擇性。這3種類型的自噬雖然具有形態(tài)上的差異，但都達(dá)到了將內(nèi)容物轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體降解和循環(huán)利用的目的。

2 自噬過程中的分子機(jī)制

2.1 自噬的誘導(dǎo) 自噬的全過程受自噬基因(autophagy-related genes,ATGs)和自噬蛋白(autophagy-related proteins，Atgs)的高度調(diào)控。自噬蛋白在哺乳動物細(xì)胞中表示為ATGs，在酵母菌中表示為Atgs。細(xì)胞在內(nèi)外某些不利因素如缺氧、饑餓、受損蛋白質(zhì)蓄積、高溫、細(xì)菌入侵等的誘導(dǎo)下，其平時處于抑制狀態(tài)的自噬過程被啟動[8]。目前發(fā)現(xiàn)有30多種自噬基因，其中與誘導(dǎo)自噬密切相關(guān)的是ULK1復(fù)合物(ULK1是ATG1在哺乳動物細(xì)胞中的同源蛋白)。ULK1復(fù)合物在正常狀態(tài)下與雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞受雷帕霉素作用或缺乏營養(yǎng)時，ULK1復(fù)合物與mTORC1解離而活化[9]，或當(dāng)細(xì)胞處于其他應(yīng)激狀態(tài)時通過腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)被激活[10]?；罨腢LK1使ATG13和FIP200磷酸化，形成ULK1/2-ATG13-FIP200復(fù)合物，將其他自噬蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到吞噬泡組裝位點(phagophore assembly site, PAS)，并在此生成新月形的自噬前體膜[11]。

2.2 自噬前體的核化 繼自噬蛋白之后，下一個被募集到PAS的是含有ATG14的磷脂酰肌醇三磷酸激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)。PI3K由PIK3C3/Vps34、PIK3R4/P150和Beclin-1組成，其主要通過與Beclin-1相互作用的蛋白質(zhì)發(fā)揮調(diào)控作用，參與核化過程[12]?？缒さ鞍譇TG9和液泡膜蛋白1(VMP1)在核化階段發(fā)揮重要作用。研究表明，形成自噬前體膜所需的原料主要為線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的膜和質(zhì)膜。ATG9在介導(dǎo)這些供體細(xì)胞器為自噬體前膜的形成供給原料過程中起關(guān)鍵作用[13]。VMP1則通過其ATG結(jié)構(gòu)域與Beclin-1的BH3結(jié)構(gòu)域相互作用，將PI3K募集至自噬前體膜[14]。同時，活化的ULK1使Beclin-1和ATG14L磷酸化來增強(qiáng)PI3K的活性[14]。PI3K將磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)磷酸化轉(zhuǎn)變成磷脂酰肌醇三磷酸(PI3P)[15]，從而使自噬前體膜經(jīng)過核化成為杯狀結(jié)構(gòu)的吞噬泡(phagophore)即自噬前體。

2.3 自噬前體的延伸 自噬前體的延伸需要2個泛素樣(ubiquitin-like,UBL)蛋白系統(tǒng)的參與。第1個泛素樣蛋白系統(tǒng)是ATG12。ATG12在E1激活酶ATG7和E2結(jié)合酶ATG10的作用下依次與ATG5和ATG16結(jié)合形成ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合物[16]，該復(fù)合物與吞噬泡膜特異性結(jié)合，促進(jìn)吞噬泡的延伸。第2個泛素樣蛋白系統(tǒng)是LC3。ATG4將LC3前體切割成LC3-I，最初存在于細(xì)胞質(zhì)中。隨后LC3-I依次與ATG7和ATG3結(jié)合，并由這2種自噬蛋白加工處理，然后與磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)耦聯(lián)，形成脂質(zhì)形式的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ結(jié)合于自噬體膜上，直至自噬體與溶酶體結(jié)合，是自噬體膜的特征性標(biāo)志[17]。另外跨膜蛋白ATG9的轉(zhuǎn)運(yùn)能力和多聚化對自噬體的形成是必需的，在自噬前體膜的延伸過程中發(fā)揮重要作用[18]。

2.4 自噬體的成熟 自噬前體在延伸的過程中不斷包裹胞漿中的受損蛋白質(zhì)及異常細(xì)胞器，最終在邊緣融合成為密閉的自噬體(autophagosome)，自噬體再與內(nèi)涵體或溶酶體相互融合，成為自噬溶酶體(autolysosome)。該過程中，自噬體向溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于微管，而自噬體與內(nèi)涵體的融合需要VTI1B蛋白的參與[19]。紫外線抵抗相關(guān)基因(ultraviolet radiation resistance-associated gene,UVRAG)蛋白可以與PI3K復(fù)合物結(jié)合，并可以激活GTPase RAB7，GTPase RAB7可以促進(jìn)自噬體與溶酶體的融合[20]。自噬溶酶體形成后，其中包裹的內(nèi)容物被溶酶體水解酶降解，生成新的氨基酸、脂肪酸、核苷酸等小分子，供機(jī)體重新利用[11]。

3 自噬的調(diào)控

自噬是一個高度保守的過程，由許多不同的調(diào)節(jié)因子控制。在介導(dǎo)自噬的多條信號通路中，雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Beclin-1、P53作為它們的交叉點，對自噬的調(diào)控起關(guān)鍵作用。mTOR是一種絲氨酸和蘇氨酸激酶，由對雷帕霉素敏感的mTORC1和對雷帕霉素不敏感的mTORC2兩種功能性多蛋白復(fù)合物組成，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、蛋白合成、代謝和細(xì)胞死亡方面具有重要作用[21]。mTOR的上游是PI3K-Akt-mTORC1途徑，其最顯著的特征是調(diào)控細(xì)胞增殖[22]。Ⅰ型PI3K是一個信號傳感器，它接收上游生長因子信號，并通過3-磷酸肌醇依賴性激酶1 (PDK1)促進(jìn)Akt(蛋白激酶B)的磷酸化。Akt磷酸化后可激活mTORC1，并最終抑制自噬。mTOR的下游是ULK復(fù)合物，由Atg13 、ULK1/2和FIP200組成，這些組分都是啟動自噬體形成所必需的[9]。在正常代謝條件下，mTORC1使Atg13磷酸化，阻止ULK1、ULK2和FIP200的結(jié)合，從而抑制自噬。在機(jī)體能量缺乏時，AMPK被激活，從而抑制mTORC1和激活ULK復(fù)合物，啟動自噬體的形成[9-10]。ULK1復(fù)合物的調(diào)節(jié)信號對自噬的進(jìn)展是至關(guān)重要的，這些信號啟動Vps34與自噬啟動子Beclin-1結(jié)合，形成Beclin-1復(fù)合物。Beclin-1復(fù)合物募集其他ATG蛋白定位于自噬前體膜，促進(jìn)結(jié)合位點的形成和自噬蛋白的結(jié)合，并驅(qū)動自噬體形成的早期步驟。Beclin-1的功能可被不同的結(jié)合配體抑制或激活，例如被Bcl-2抑制和被UVRAG激活[23]。此外，腫瘤抑制蛋白P53在細(xì)胞發(fā)育中具有多種調(diào)節(jié)功能，包括誘導(dǎo)或抑制自噬。P53在自噬中的作用是位置依賴性的[24]，位于細(xì)胞核內(nèi)的P53通過激活靶基因(如DRAM)誘導(dǎo)自噬，而位于細(xì)胞質(zhì)中的P53則以細(xì)胞周期依賴性方式抑制自噬，但其抑制自噬的機(jī)制目前尚不完全清楚。

4 自噬與腎纖維化

腎纖維化是腎臟遭受內(nèi)外多種致病因素的刺激，發(fā)生固有細(xì)胞損傷和大量膠原聚積，造成腎實質(zhì)硬化和瘢痕形成，最終導(dǎo)致腎功能完全喪失的一種病理生理改變。其發(fā)生機(jī)制的主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的異常沉積[1]。在進(jìn)行性腎臟疾病中，無論初始病因如何，腎纖維化是終末期腎病(ESRD)的共同途徑。在體外和體內(nèi)研究中已經(jīng)表明，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)的上調(diào)在腎纖維化的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，其中TGF-β1是其最豐富的同種型，已被確立為腎纖維化的中樞介質(zhì)[2]。TGF-β1可通過Smad3依賴性或非依賴性機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)(如Ⅰ型膠原蛋白和纖維連接蛋白)的產(chǎn)生，也可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和誘導(dǎo)MMP的天然抑制劑即金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)來抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解[3]。最近研究表明，TGF-β1可調(diào)節(jié)自噬，而自噬可調(diào)節(jié)與腎纖維化相關(guān)的信號通路，如腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化和糖尿病腎病[25-26]。在腎纖維化中，TGF-β1是一種具有雙重功能的多效細(xì)胞因子，既能誘導(dǎo)膠原蛋白合成，又能誘導(dǎo)自噬和促進(jìn)膠原蛋白的降解[2]。膠原蛋白合成和降解之間的平衡對于維持組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。并且，TGF-β可以通過PI3K/Akt激活mTOR通路，因此它可能對自噬起激活和抑制的雙重作用，這可能取決于特定的細(xì)胞類型和環(huán)境[3]。有研究表明，自噬的上調(diào)和下調(diào)都可能影響腎纖維化的轉(zhuǎn)歸和發(fā)展[4,27]。由此可見，自噬對腎纖維化的作用可能是多方面的和細(xì)胞特異性的。

5 自噬在腎纖維化中的作用

5.1 自噬抗腎纖維化的作用與機(jī)制 自噬可抑制腎纖維化，并且是維持腎臟和系膜細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)所必需的。目前已有的研究表明，自噬抑制腎纖維化的機(jī)制主要是通過促進(jìn)活性TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白(Col-Ⅰ)的降解[2]。TGF-β1是腎纖維化的有效誘導(dǎo)劑，可誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，包括膠原蛋白和纖維連接蛋白，其過度生產(chǎn)和逐漸積累是腎纖維化的標(biāo)志。同時，TGF-β1也是自噬的重要誘導(dǎo)物，在體外培養(yǎng)的人腎近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)中，TGF-β1誘導(dǎo)自噬體的積累和自噬蛋白LC3的轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)成熟TGF-β1的降解來抑制腎纖維化的進(jìn)展[28]。并且，LC3介導(dǎo)的自噬可降解腎小管上皮細(xì)胞(RTEC)中的成熟TGF-β，從而減少TGF-β分泌并抑制由單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)和腎損傷誘導(dǎo)的腎纖維化。此外，自噬蛋白Beclin-1亦有助于防止腎臟中膠原蛋白的過度沉積[28]。在腎纖維化的發(fā)展過程中，另一個重要因素是系膜細(xì)胞(MC)。在腎損傷和進(jìn)展性腎病過程中，系膜細(xì)胞進(jìn)行增殖并產(chǎn)生過多的細(xì)胞外基質(zhì)，膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，Col-Ⅰ是與纖維化相關(guān)的主要類型。TGF-β1誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞自噬，可通過降解細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ減少細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和防止不溶性前膠原蛋白的過度積累[5]，從而抑制腎纖維化。另有研究發(fā)現(xiàn)，自噬還可保護(hù)腎小管細(xì)胞免受環(huán)孢霉素A(CsA)誘導(dǎo)的凋亡[29]，明顯減輕腎功能障礙。除腎小管細(xì)胞外，腎損傷過程中誘導(dǎo)的自噬可保護(hù)系膜細(xì)胞免于凋亡，說明自噬不僅可保護(hù)上皮細(xì)胞，也可保護(hù)間充質(zhì)細(xì)胞。此外，在自噬的調(diào)節(jié)因子中，mTOR抑制劑抗纖維化作用的相關(guān)研究表明，雷帕霉素抑制mTORC1信號通路對糖尿病腎病具有較強(qiáng)的腎臟保護(hù)作用[30-31]。但mTOR抑制劑抗纖維化作用的機(jī)制主要是由于其對自噬的間接誘導(dǎo)作用，還是由于其抗增殖活性，目前尚存在爭議。

5.2 自噬促進(jìn)腎纖維化的作用與機(jī)制 自噬不僅可以抑制腎纖維化，也能促進(jìn)腎纖維化。例如，在UUO導(dǎo)致的腎纖維化小鼠模型研究中，持續(xù)激活腎小管細(xì)胞自噬促進(jìn)腎纖維化[4]。自噬促進(jìn)腎纖維化的機(jī)制主要是通過誘導(dǎo)腎小管萎縮和分解[32]。在腎纖維化中，自噬和腎小管萎縮的聯(lián)系最初也是在單側(cè)輸尿管梗阻的動物研究中提出的。研究表明，自噬在阻塞的腎小管中被激活，表現(xiàn)為自噬體積聚、Beclin-1表達(dá)增加和LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化[4]。這些變化伴隨著自噬溶酶體的增加和活性增強(qiáng)，進(jìn)一步表明在阻塞的腎小管中誘導(dǎo)的自噬增強(qiáng)。伴隨著自噬，在阻塞的腎小管中也誘導(dǎo)了腎小管細(xì)胞凋亡。重要的是，腎小管萎縮的發(fā)展與自噬和凋亡呈時間依賴性，提示自噬可能與細(xì)胞凋亡協(xié)同作用，誘導(dǎo)腎小管萎縮和腎單位喪失[4]。在類似研究中，Koesters等[33]通過在腎小管中過表達(dá)TGF-β1的四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的持續(xù)表達(dá)在腎小管細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬，具有自噬特征的腎小管塌陷，細(xì)胞碎片填充殘留腔。這些變化與廣泛的腎小管周圍纖維化有關(guān)。這種退化變性的細(xì)胞其細(xì)胞核顯示正常染色，未見表示凋亡的TUNEL染色陽性?？傊@些結(jié)果表明自噬是TGF-β1誘導(dǎo)的腎纖維化中腎小管萎縮和分解的主要原因。除該機(jī)制外，另有研究表明，雷帕霉素激活自噬可誘導(dǎo)促纖維化信號傳導(dǎo)級聯(lián)效應(yīng)[34]；而不受雷帕霉素直接影響的mTORC2/Rictor信號通路是TGF-β誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞活化的重要下游分支，該通路的激活高度促進(jìn)腎纖維化的進(jìn)展[35]。此外，通過TGF-β的正向前饋機(jī)制起作用的活性氧(ROS)是細(xì)胞應(yīng)激中自噬的有效激活劑，其主要通過抑制mTOR介導(dǎo)的途徑起作用[36]。這表明自噬可通過激活非Smad信號通路(包括ROS的產(chǎn)生)促進(jìn)纖維化。但是，自噬在腎纖維化中的病理生理學(xué)影響仍需要進(jìn)一步研究來闡明。

6 展望

自噬作為細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的一種適應(yīng)性反應(yīng)和保護(hù)機(jī)制，在機(jī)體許多生物學(xué)過程中起重要作用。自噬的失調(diào)是導(dǎo)致多種疾病包括腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制。已有研究表明，自噬失調(diào)與腎纖維化疾病密切相關(guān)，并支持自噬是一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制的觀點。自噬是腎損傷中應(yīng)激適應(yīng)性反應(yīng)不可缺少的機(jī)制，通過清除蛋白聚合物和受損細(xì)胞器，以及負(fù)向調(diào)節(jié)和防止腎臟中基質(zhì)蛋白的過量積累，促進(jìn)細(xì)胞存活和抗纖維化。但是，也有研究表明自噬促進(jìn)腎纖維化。自噬在腎纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用可能是多方面和復(fù)雜的?；谀壳瓣P(guān)于自噬在腎纖維化中的研究仍處于起步階段，在未來的研究中，有必要進(jìn)一步加深對自噬的機(jī)制和生理功能的認(rèn)識，確定自噬是否可能成為預(yù)防或減輕腎纖維化發(fā)病機(jī)制的有效治療靶點。