CHFR基因甲基化與消化道腫瘤發(fā)生及對(duì)化療藥物敏感性的研究新進(jìn)展

陳苗綜述 馮立，邢智審校

腫瘤是目前危害人類(lèi)健康的主要疾病之一，明確腫瘤的發(fā)生機(jī)制對(duì)于早期診斷和治療是極其重要的課題。目前，部分腫瘤發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，因此，人們探索能在腫瘤發(fā)生的早期就能被檢測(cè)出來(lái)的標(biāo)記物。經(jīng)過(guò)大量研究發(fā)現(xiàn)CHFR(checkpoint with forkhead-associated and ring finger)蛋白在正常組織中廣泛表達(dá)，而在癌組織中表達(dá)缺失或減少，CHFR基因的缺失最初是在結(jié)直腸癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中被發(fā)現(xiàn)的，然后在食管癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、胃癌中也有報(bào)道[1-4]。而啟動(dòng)子CpG 島的甲基化是導(dǎo)致CHFR 基因表達(dá)缺失或沉默的重要機(jī)制，由此而引發(fā)腫瘤的發(fā)生。

1 CHFR基因的結(jié)構(gòu)和功能

1.1 CHFR基因的定位和結(jié)構(gòu) CHFR基因定位在染色體12q24.3，其編碼產(chǎn)物為含664個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，包含一個(gè)N-端(forkhead-associated,FHA)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)中心環(huán)指區(qū)(ring finger,RF)和一個(gè)富含半胱氨酸的C端結(jié)構(gòu)域。環(huán)指區(qū)域?qū)HFR泛素化活性非常重要，是含鋅的蛋白質(zhì)折疊，它編碼了一個(gè)E3泛素酶的家族[5]。在富含半胱氨酸的區(qū)域內(nèi)，RaR-結(jié)合鋅指(PBZ)位于能夠結(jié)合聚(APP-核糖)PARP家族成員(如PARP-1)的位置。FHA區(qū)是許多轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶結(jié)合DNA復(fù)制叉的特定區(qū)域，許多包含F(xiàn)HA區(qū)的蛋白質(zhì)是細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，CHFR基因同樣是一個(gè)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，因此命名為CHFR。CHFR的FHA區(qū)能識(shí)別并結(jié)合磷酸化蛋白質(zhì)，它在檢查點(diǎn)和DNA修復(fù)蛋白質(zhì)中頻繁發(fā)現(xiàn)[6]。

1.2 CHFR基因的生物學(xué)功能

1.2.1 CHFR蛋白是泛素化連接酶: CHFR通過(guò)泛素化連接酶的功能影響有絲分裂檢查點(diǎn)，該連接酶的作用不是為了降解，而是為了激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)催化形成非經(jīng)典Lys63-linked聚泛素化鏈[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，CHFR還可以泛素化并調(diào)控TOPK的表達(dá)[7]。TOPK是一種有絲分裂絲氨酸/蘇氨酸激酶，可磷酸化下游底物PTEN并使其失活，從而導(dǎo)致AKT活化。CHFR通過(guò)抑制TOPK，抑制了AKT的誘導(dǎo)激活，從而阻斷G2/M的進(jìn)展。

1.2.2 CHFR是細(xì)胞周期檢查點(diǎn): CHFR是一種早期有絲分裂檢查點(diǎn)基因，也是細(xì)胞啟動(dòng)DNA和染色體損傷修復(fù)機(jī)制的關(guān)鍵，在控制染色體完整性方面起著重要作用[1]。有絲分裂檢查點(diǎn)能保證染色體正確的分配給下一代。細(xì)胞周期G2/M過(guò)渡期對(duì)各種應(yīng)激都很敏感，大多數(shù)情況下并不損傷DNA，如當(dāng)細(xì)胞受到放療、低溫、缺氧等刺激時(shí)，它們會(huì)激活前期檢查點(diǎn)，阻止細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂。事實(shí)上，該過(guò)程大部分情況下是可逆的，經(jīng)過(guò)一個(gè)適應(yīng)調(diào)節(jié)階段或當(dāng)應(yīng)激解除時(shí)，有絲分裂又重新開(kāi)始。細(xì)胞短暫地停在G2末期，稱(chēng)為“預(yù)前期”，有研究發(fā)現(xiàn),預(yù)前期主要是由CHFR為主的途徑誘導(dǎo)發(fā)生的，CHFR在所有正常組織的細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá)，在微管中毒或輻射損傷時(shí)在細(xì)胞核中積累。在定位到細(xì)胞核后，CHFR被PI3K信號(hào)通路中的蛋白激酶B(PKB/AKT)磷酸化。在細(xì)胞周期的不同階段，CHFR表達(dá)水平波動(dòng)很大，微管應(yīng)力將導(dǎo)致CHFR表達(dá)水平升高和有絲分裂抑制。相反，由AKT刺激的自氧化還原活性和CHFR降解是進(jìn)入有絲分裂的先決條件[8]。因此，CHFR也控制著G2/M轉(zhuǎn)變的細(xì)胞周期進(jìn)程。

1.2.3 CHFR是腫瘤抑制因子：Yu等[9]通過(guò)建立小鼠敲除模型發(fā)現(xiàn)，缺乏CHFR的小鼠易患癌癥，發(fā)生自發(fā)性腫瘤，該結(jié)果表明CHFR是一種腫瘤抑制因子，通過(guò)控制關(guān)鍵分裂蛋白(如Aurora A)的表達(dá)水平來(lái)確保染色體的穩(wěn)定性。此外，最近的一項(xiàng)研究表明，CHFR除了作為腫瘤抑制因子，還在調(diào)節(jié)促炎性趨化因子白細(xì)胞介素-8(IL-8)表達(dá)方面具有額外的作用。CHFR能夠抑制NF-κB信號(hào)通路和引發(fā)后來(lái)細(xì)胞遷移及減少血管生成，失活CHFR觸發(fā)NF-κB信號(hào)活動(dòng)，從而加速血管生成和轉(zhuǎn)移表型，與不良預(yù)后相關(guān)[10]。

2 CHFR甲基化與消化道腫瘤發(fā)生的關(guān)系

2000年Scolnick等[1]發(fā)現(xiàn)CHFR基因的表達(dá)缺失與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，之后大量的研究對(duì)腫瘤中CHFR基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),證實(shí)了CHFR在腫瘤中的表達(dá)缺失，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了CHFR的表達(dá)沉默與啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化有關(guān)。2006年 Morioka等[11]研究發(fā)現(xiàn), 38例原發(fā)食管癌腫瘤組織中有9例CHFR基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化，而對(duì)應(yīng)的正常組織沒(méi)有觀察到甲基化現(xiàn)象。之后Mohammed等[12]用定量RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常食管組織相比79%的食管腺癌中CHFR轉(zhuǎn)錄物表達(dá)下調(diào);免疫組化分析75例食管腺癌樣本，有75%的CHFR蛋白表達(dá)缺失，甲基化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)31%的腫瘤樣本CHFR啟動(dòng)子區(qū)DNA超甲基化，證明CHFR甲基化在食管癌組織中廣泛表達(dá)。吳書(shū)勝等[13]研究了CHFR在食管癌、食管上皮內(nèi)瘤變及正常食管組織中蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)92例食管癌組織中CHFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率僅為7.61%，食管上皮內(nèi)瘤變組織陽(yáng)性表達(dá)率為54.55%，正常食管組織為96.3%；高分化的食管癌組織中蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為33.33%，明顯高于中—低分化的食管癌組織CHFR蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的1.35%，該研究表明CHFR在食管癌中表達(dá)沉默是頻發(fā)事件，基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化是表達(dá)沉默的主要原因，可能與食管癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其與食管癌分化程度的關(guān)系可能更為密切。在胃癌中，2003年Satoh等[14]就對(duì)胃癌的有絲分裂檢查點(diǎn)基因CHFR的表觀遺傳失活進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)20%的胃癌細(xì)胞系和39%的原發(fā)性胃癌的CHFR表達(dá)被DNA甲基化抑制。此外，未表達(dá)CHFR的細(xì)胞表現(xiàn)出檢查點(diǎn)功能受損，導(dǎo)致2種微管抑制劑多西他賽和紫杉醇治療后cyclin B1的核定位。表明了CHFR異常甲基化是預(yù)測(cè)胃癌對(duì)微管抑制劑敏感性的分子標(biāo)記物。2016年Sepulveda等[15]研究了從非化生的胃黏膜到腸化生，從腸化生到胃癌的DNA樣本，結(jié)果顯示，CHFR在胃癌和非化生黏膜中顯著增加了CpG甲基化，并且CHFR基因的CpG甲基化水平在致癌階段逐漸增加。之后Shi等[16]對(duì)13項(xiàng)研究做了Meta分析，其中包括758例胃癌病例和641例對(duì)照者，結(jié)果表明CHFR的甲基化與胃癌風(fēng)險(xiǎn)的增加有顯著相關(guān)性，并且發(fā)現(xiàn)CHFR甲基化是胃癌的早期表觀遺傳事件。最近Ding等[17]匯集了15項(xiàng)研究，包括827例胃癌患者，薈萃分析數(shù)據(jù)顯示：在胃癌中，CHFR啟動(dòng)子甲基化的頻率高于正常胃組織，并發(fā)現(xiàn)CHFR甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著的相關(guān)性。在結(jié)直腸癌(CRC)中，最新研究表明CHFR啟動(dòng)子甲基化不僅是CRC的診斷生物標(biāo)記，而且是一個(gè)預(yù)后標(biāo)志。Sun等[18]匯集了7項(xiàng)研究包括966例結(jié)直腸癌患者，檢測(cè)癌組織CHFR啟動(dòng)子甲基化的頻率與正常結(jié)腸黏膜組織相比較，結(jié)果表明癌組織中CHFR啟動(dòng)子甲基化的頻率顯著增加，CHFR啟動(dòng)子超甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)也顯著相關(guān)。另外CHFR啟動(dòng)子超甲基化與CRC患者的整體存活率顯著相關(guān)。Zhang等[19]在5個(gè)胰腺癌細(xì)胞系中測(cè)量了CHFR表達(dá)，在Capan1細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)CHFR降低了增殖率，減少了細(xì)胞遷移和入侵能力。數(shù)據(jù)顯示，CHFR通過(guò)G1期阻滯來(lái)調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，同時(shí)它也作為一種重要的腫瘤抑制因子在體外發(fā)揮作用，然而CHFR的過(guò)度表達(dá)并不是微管抑制劑引起的細(xì)胞凋亡的有利因素。結(jié)果表明CHFR作為胰腺癌的腫瘤抑制因子，其在控制胰腺癌細(xì)胞周期中有潛在作用。

多項(xiàng)研究表明，CHFR啟動(dòng)子CpG島甲基化不僅可以在原發(fā)性癌癥中檢測(cè)到，在血液(NSCLC)、糞便(CRC)和腹膜液(胃癌)中也可以檢測(cè)到[20-23]。這為CHFR作為診斷標(biāo)記物提供了支持。

3 CHFR甲基化與化療藥物敏感性的關(guān)系

微管靶向化療藥物如紫杉醇是最廣泛使用的一線和二線化療藥物，用于治療最常見(jiàn)的惡性腫瘤，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌，但對(duì)紫杉烷類(lèi)的一級(jí)耐藥是常見(jiàn)的，并且是一個(gè)重要的臨床問(wèn)題，具有叉頭和環(huán)指結(jié)構(gòu)域的有絲分裂檢查點(diǎn)基因近年來(lái)成為抵抗微管靶向性的關(guān)鍵介質(zhì)。胃癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌的啟動(dòng)子高甲基化或CHFR蛋白表達(dá)減少導(dǎo)致的表觀遺傳沉默，成為紫杉烷和多西他賽敏感性的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。在胃癌細(xì)胞系中， Satoh等[14]首次發(fā)現(xiàn)，CHFR表達(dá)與微管抑制劑敏感性降低有關(guān)。另有研究報(bào)道，在胃癌患者中，CHFR甲基化可作為多西他賽敏感標(biāo)志物[24]。在結(jié)腸癌中也有研究表明，CHFR啟動(dòng)子甲基化對(duì)多西他賽及吉西他濱敏感性增加[25]。CHFR啟動(dòng)子CpG島甲基化在預(yù)測(cè)微管抑制劑反應(yīng)中具有潛在作用。例如，宮頸腺癌細(xì)胞系中有CHFR啟動(dòng)子CpG島甲基化，對(duì)多西他賽和紫杉醇治療敏感，5-Aza-2-去氧胞苷治療后CHFR表達(dá)立即恢復(fù)，對(duì)這些藥物的敏感性降低[26]。有研究分析了轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌中CHFR失活和紫杉醇的反應(yīng)，用MSP檢測(cè)CHFR啟動(dòng)子CpG島甲基化，通過(guò)甲基化微陣列驗(yàn)證，免疫組織化學(xué)分析CHFR的核表達(dá)。雖然只有1/32的患者觀察到CHFR啟動(dòng)子CpG島甲基化，但16/41的患者顯示出CHFR核染色減少，這表明除了啟動(dòng)子CpG島甲基化外，還有一個(gè)CHFR抑制事件有待闡明。在這項(xiàng)研究中，與CHFR核表達(dá)升高的患者相比，核CHFR表達(dá)減少的患者治療反應(yīng)更好并能延長(zhǎng)整體生存率[27]。這些研究共同有力地支持了CHFR失活作為紫杉烷、多西他賽敏感性標(biāo)記的證據(jù)。

4 結(jié)論與展望

近年來(lái)，大量試驗(yàn)研究了CHFR表達(dá)失活與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，通常是由于啟動(dòng)子CpG島甲基化，可以作為預(yù)測(cè)各種癌癥微管抑制劑的預(yù)后和反應(yīng)的生物標(biāo)志物。大多數(shù)的研究都表明CHFR啟動(dòng)子區(qū)甲基化與腫瘤的發(fā)生具有相關(guān)性，并且顯示CHFR高甲基化腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的藥物敏感性有影響，但是一部分研究卻發(fā)現(xiàn)了不同的結(jié)論。 Homma等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在低度惡性非侵襲性胃癌中CHFR高甲基化陽(yáng)性率為10%，高度惡性非侵襲性胃癌陽(yáng)性率為63%，在黏膜下侵襲性腺癌的CHFR高甲基化陽(yáng)性率為35%，高度惡性非侵襲性癌的CHFR甲基化陽(yáng)性率比低度惡性者高，未發(fā)現(xiàn)CHFR高甲基化和染色體不穩(wěn)定性之間存在相關(guān)性。在小凹上皮型和普通表型的腫瘤中頻繁發(fā)現(xiàn)CHFR高甲基化，在完全腸道化生型中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。另外還發(fā)現(xiàn)高甲基化在70歲以上的患者中更為常見(jiàn),并且在一些非腫瘤的老年人胃上皮中也有發(fā)現(xiàn)。因此，盡管CHFR甲基化與染色體不穩(wěn)定性無(wú)關(guān)，但一些有凹腔或普通表型的胃腫瘤可能是CHFR年齡相關(guān)性甲基化結(jié)果。并且Yoshida等[29]回顧性分析41例胃癌患者，通過(guò)DNA亞硫酸鹽聯(lián)合限制性?xún)?nèi)切分析，檢測(cè)CHFR基因的甲基化狀態(tài)，并比較甲基化狀態(tài)對(duì)化療的敏感性，研究表明單獨(dú)CHFR基因甲基化不能預(yù)測(cè)晚期和復(fù)發(fā)性胃癌對(duì)多西他賽和紫杉醇的反應(yīng)，紫杉醇和多西他賽都可能有效治療胃癌，即使CHFR表達(dá)。

CHFR基因甲基化有望作為無(wú)創(chuàng)的診斷腫瘤分子標(biāo)記物，為了更好地應(yīng)用于腫瘤中，還需進(jìn)行大樣本的數(shù)據(jù)分析。以往的研究已發(fā)現(xiàn)CHFR高甲基化使腫瘤細(xì)胞沉默，下一步的實(shí)驗(yàn)可以嘗試對(duì)于化療藥物耐藥的細(xì)胞給予促進(jìn)甲基化藥物，或者進(jìn)行甲基化轉(zhuǎn)染，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，達(dá)到抑制或治療的目的，因此，可以通過(guò)促進(jìn)或抑制患者CHFR基因甲基化而成為治療腫瘤的新途徑。CHFR甲基化除了對(duì)化療藥物敏感外，在放療方面似乎也有影響，目前已在食管癌中發(fā)現(xiàn)它具有放射抵抗性[30]，但由于研究樣本數(shù)較少，缺乏說(shuō)服力，還需進(jìn)一步地研究來(lái)證實(shí)。