茶皂素提取條件的優(yōu)化及純化研究

孫萬里

(江西省宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院, 江西 宜春 336000)

茶皂素又稱茶皂苷，是一類天然糖苷化合物，茶皂素主要來源于油茶(CamelliaoleiferaAbel)，具有一般皂苷的通性，茶皂素難溶于無水甲醇、無水乙醇、冷水，且不溶于丙酮、苯、乙醚、石油醚等有機溶劑[1]，易溶于含水甲醇和乙醇，是一種非離子型極性物質(zhì)，其分子中有親水性的糖體和疏水性的配位基團，具有乳化、分散、潤濕、發(fā)泡、去污等功能和溶血、抗菌、抗病毒、降血脂等生理活性[2-4]。因此，茶皂素在日用化工、農(nóng)藥、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。

目前，茶皂素的提取方法主要有2種：一是水提法[5]，利用茶皂素溶于熱水的性質(zhì)，選取熱水作為浸提劑從而將茶皂素提取出來。水提法雖然簡單易操作，但是浸出的成分復(fù)雜，不利于后續(xù)分離純化，且耗能較多；二是有機溶劑提取，有乙醇、甲醇提取法等，這2種方法中乙醇的安全性更高，甲醇毒性大，且甲醇提取過程中帶入的雜質(zhì)較多，導(dǎo)致產(chǎn)品純度降低[6-7]。楊坤國等[8]嘗試用無水乙醇回流提取茶籽中茶皂素，趁熱過濾，使得粗產(chǎn)品和原料迅速分離，提取收率為9.7%、純度80.1%的茶皂素。

初步提取的茶皂素含有多酚類化合物、多糖類、植物色素和粗脂肪、粗纖維等雜質(zhì)，需要進一步純化，才能達到一定的純度。目前，如何進一步提高茶皂素純度和降低提取費用仍然是一個有待解決的問題。分離純化茶皂素的方法有沉淀、溶劑萃取、膜分離、硅膠柱層析、高速逆流色譜分離以及大孔吸附樹脂分離等，其中采用大孔樹脂吸附法[9]或超濾膜法[10]來純化茶皂素被認為是一種具有巨大推廣價值的方法，在樹脂吸附后，通過水洗、堿洗和醇洗等步驟可以有效地將茶皂素與雜質(zhì)進行分離。有報道表示采用大孔吸附樹脂吸附法提取的茶皂素收率、純度和色澤等指標都明顯高于傳統(tǒng)工藝所制得的茶皂素[11]。因此，本研究采用油茶茶籽餅為原料，經(jīng)乙醇水溶液提取茶皂素后，用大孔樹脂NKA-9純化茶皂素進行前期提取和純化的初步研究，以期為茶皂素開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料、試劑與儀器

油茶茶籽餅由江西青龍高科集團提供；NKA-9型大孔樹脂購于天津南開波鴻樹脂科技有限公司；無水乙醇(純度99.5%)、石油醚(沸程60～90 ℃)、香草醛(純度99%)、茶皂素標準品(純度98%)。

BZ40138索式提取器，上海洪紀儀器設(shè)備有限公司；722-100型可見分光光度計，上海天普分析儀器儀表有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 茶皂素的提取

1.2.1原料預(yù)處理 取一定量的茶籽餅，粉碎，于恒溫干燥箱中在60 ℃下干燥4 h或以上，控制茶籽粉的水分≤5%。過篩篩分出粒徑0.4 mm茶籽粉，加入一定量的石油醚經(jīng)索式抽提器抽提4～6 h，直至抽提液無色，其目的是除去油脂以防后續(xù)干擾[12]。將經(jīng)脫脂處理過的茶籽粉置于通風(fēng)良好處自然風(fēng)干，后于干燥箱中60 ℃條件下干燥4 h烘干備用。

1.2.2標準曲線的建立 采用香草醛-濃硫酸顯色法[13]檢測茶皂素的含量。首先，準確稱取茶皂素標準品0.04 g，用體積分數(shù)80%乙醇溶液將其溶解于20 mL容量瓶中，定容至刻度后搖勻，得到茶皂素質(zhì)量濃度為2 g/L的標準溶液。然后，準確稱取8 g香草醛于100 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，配制香草醛乙醇溶液。用移液槍精密移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL茶皂素標準溶液分別放置于5個比色管中，加入蒸餾水直到溶液體積均為0.5 mL，精密加入香草醛乙醇溶液0.5 mL，并將比色管置于冰水混合物中，分別移取4 mL 77%濃硫酸于比色管中，搖勻。將比色管置于60 ℃恒溫水浴鍋中水浴15 min，再將其置于冰水混合物中反應(yīng)10 min，取出恢復(fù)至室溫。取配置好的樣品溶液，以空白試劑為對照，在波長550 nm處測定吸光度(A)，以A為縱坐標，茶皂素標準品溶液質(zhì)量濃度(x, g/L)為橫坐標作標準曲線，得標準曲線方程:A=0.904x+0.007 7,相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8。

1.2.3提取流程及優(yōu)化 準確稱取2 g經(jīng)脫脂處理的茶籽粉于250 mL錐形瓶中，以一定體積的不同體積分數(shù)的乙醇水溶液作為浸提液，在一定溫度下恒溫水浴浸提一定時間，在λ=550 nm處分別測定A，由標準曲線方程換算成浸提液中茶皂素質(zhì)量濃度，進而算出得率。分別考察料液比、浸提液乙醇體積分數(shù)、浸提溫度、浸提時間對茶皂素得率的影響，從而選出最佳的工藝條件。提取得率(y)計算公式：y=C×V/m×100%(其中，C為浸提液中茶皂素質(zhì)量濃度，g/L;V為浸提液體積,mL;m為原料的質(zhì)量,g)。

1.3 大孔樹脂NKA-9純化茶皂素

1.3.1茶皂素粗提液的制備 將最佳單因素提取試驗所得提取液經(jīng)過濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，真空干燥，可得到粗茶皂素。準確稱取1 g粗茶皂素用熱水溶解，然后進行抽濾以除去不溶物質(zhì)，再用蒸餾水定容至1 000 mL容量瓶中，備用。

1.3.2大孔吸附樹脂預(yù)處理 將NKA-9型大孔吸附樹脂放于無水乙醇中浸泡8 h，除去醇溶物，然后用蒸餾水反復(fù)洗滌至無醇味。在5%的鹽酸中浸泡3 h，用蒸餾水洗至中性，再用5% NaOH溶液浸泡3 h，蒸餾水洗至中性，備用[14]。

1.3.3靜態(tài)吸附與解吸

1.3.3.1吸附時間的影響 準確稱取2 g預(yù)處理過的NKA-9樹脂置于250 mL錐形瓶中，加入50 mL 1 g/L茶皂素粗提液，樹脂吸附前皂茶素的質(zhì)量濃度(C0)為0.667 g/L，溫度為37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min條件下振蕩 3 h，每30 min測一次溶液中茶皂素的質(zhì)量濃度，按式(1)和(2)計算吸附量和吸附率：

Q=(C0-C′)×V′/m′

(1)

W=(C0-C′)/C0×100%

(2)

式中：Q—吸附量，mg/g；W—吸附率，%；C0—吸附前茶皂素的質(zhì)量濃度，g/L；C′—吸附后粗提液中殘余茶皂素的質(zhì)量濃度，g/L；V′—茶皂素粗提液的體積，mL；m′ —大孔吸附樹脂的質(zhì)量，g。

(3)

式中：D—解吸率，%；C1—解吸后解吸液中茶皂素的質(zhì)量濃度，g/L。

1.3.4動態(tài)吸附與解吸 稱取一定量的預(yù)處理好的NKA-9型樹脂濕法上柱，將質(zhì)量濃度1 g/L的茶皂素粗提液上樣，控制一定的流速，上樣完畢，用50 mL的蒸餾水洗，水洗后再用一定量不同體積分數(shù)的乙醇溶液進行洗脫，控制一定的洗脫流速，測定洗脫液中茶皂素的質(zhì)量濃度。茶皂素純度由洗脫液中茶皂素與干物質(zhì)的質(zhì)量比值計算得到。

2 結(jié)果與討論

表1 不同浸提條件對茶皂素得率的影響

2.1 浸提條件對茶皂素得率的影響

2.1.1料液比 考察不同料液比對茶皂素得率的影響，以體積分數(shù)95%乙醇水溶液為浸提液，60 ℃恒溫水浴浸提2 h，結(jié)果見表1。由表可知隨著料液比的減小，茶皂素得率隨之增大，而到了料液比 1∶11(g ∶mL，下同)時，茶皂素得率反而下降，可能是茶皂素提取過程中，需要一定量的提取劑才能完全滲透至原料的微孔中，進而溶解出茶皂素，而料液比1∶11時，茶皂素得率下降，可能是由于浸提液過多，稀釋了茶皂素的緣故?？紤]到能耗及得率，確定最佳料液比為1∶9。

2.1.2乙醇體積分數(shù) 考察不同的乙醇體積分數(shù)對茶皂素得率的影響，料液比為1∶9，60 ℃恒溫水浴浸提2 h，結(jié)果見表1。由表可知,乙醇體積分數(shù)小于60%時，可能是乙醇濃度小，含水較多，達不到應(yīng)有的浸取效果，故浸提液中茶皂素質(zhì)量濃度不高，以體積分數(shù)50%乙醇水溶液浸提得率為11.3%,而乙醇體積分數(shù)為60%時，茶皂素得率最高達到11.8%，由此確定最佳浸提液體積分數(shù)為60%乙醇水溶液。隨著乙醇體積分數(shù)逐漸增大，茶皂素的質(zhì)量濃度反而降低，可能是茶皂素不溶于無水乙醇，浸提液中含醇較多的緣故。

2.1.3浸提溫度 考察不同的浸提溫度對茶皂素得率的影響，料液比為1∶9，以體積分數(shù)60%乙醇水溶液為浸提液，浸提時間2 h，結(jié)果見表1。從表中可知從50到80 ℃這一段，茶皂素得率變化不大，而90 ℃時，茶皂素得率突增，可以解釋為溫度過高，乙醇揮發(fā)導(dǎo)致浸提液量變少，在時間一定的前提下，90 ℃ 時的浸提液量少，導(dǎo)致其中的茶皂素質(zhì)量濃度過高。從能耗角度考慮，確定60 ℃為最佳的浸提溫度。

2.1.4浸提時間 考察不同的浸提時間對茶皂素得率的影響，料液比為1∶9，以體積分數(shù)60%乙醇水溶液為浸提液，浸提溫度60 ℃，結(jié)果見表1。由表可知，隨著時間的遞增，茶皂素得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，先上升可能是茶皂素從原料中滲透出來至浸提液中需要一定的時間所致，后下降可能是時間長了茶皂素易失活的緣故，故最佳的浸提時間為3 h，此時茶皂素得率最高為14.9%。

綜上所述，在單因素試驗中，提取茶皂素最佳的工藝條件為液料比1∶9(g ∶mL)，浸提液乙醇體積分數(shù)60%，浸提溫度60 ℃，浸提時間3 h，此時茶皂素得率最高可達到14.9%,浸提液茶皂素純度為67%。

2.2 NKA-9型樹脂靜態(tài)吸附和解吸

2.2.1靜態(tài)吸附動力學(xué) 靜態(tài)吸附時間對吸附量的影響見圖1。根據(jù)圖1可知，NKA-9型樹脂在0～2 h內(nèi)，其吸附量隨時間增加而迅速增大，吸附0.5 h 基本飽和，2 h以后吸附量的增加趨于緩慢。由此可以看出，NKA-9型樹脂是一種快速吸附型樹脂，這對實際生產(chǎn)中的應(yīng)用極為有利，將極大提高生產(chǎn)效率，同時得到NKA-9型樹脂實驗所得最大吸附量為10.73 mg/g。

2.2.2洗脫劑體積分數(shù)對解吸效果的影響 不同洗脫劑體積分數(shù)對靜態(tài)吸附效果的影響見圖2。根據(jù)圖2可知，茶皂素的解吸率與乙醇體積分數(shù)成正相關(guān)，體積分數(shù)70%和80%的乙醇靜態(tài)解吸率分別為83%和91.1%。從經(jīng)濟性角度考慮，可選擇體積分數(shù)70%乙醇為適宜的洗脫劑，如果從解吸效果來考慮，可選用體積分數(shù)80%乙醇進行洗脫。

圖1 NKA-9型樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

圖2 乙醇體積分數(shù)對靜態(tài)解吸率的影響

2.3 NKA-9型樹脂動態(tài)吸附

2.3.1泄露曲線 由于樹脂吸附容量一定，當大孔樹脂吸附達到一定容量時，其對物質(zhì)的吸附減弱甚至消失[15]，因此動態(tài)吸附選擇合適的上樣量是樹脂純化技術(shù)的關(guān)鍵，而泄露曲線就是為了選擇合適的上樣量。實驗結(jié)果從圖3可以看出，上樣量到25～50 mL之間，流出液中茶皂素質(zhì)量濃度呈大幅上升趨勢，50到125 mL之間，幅度減小，125 mL 之后，流出液茶皂素質(zhì)量濃度趨于平緩，可能是樹脂達到了吸附飽和狀態(tài)。考慮到盡量接近樹脂的吸附容量，因此選擇125 mL上樣量最為合適。

2.3.2上樣流速對吸附率的影響 上樣流速對吸附率的影響如圖4所示。由圖4可知，吸附率與上樣流速成反比，可以認為流速變大，茶皂素在樹脂內(nèi)的擴散速度變慢，導(dǎo)致吸附率減小。當上樣流速為2.5 mL/min時，吸附率最大為73.58%，2.5～6.5 mL/min時，吸附率沒有明顯減小，而當上樣流速為8 mL/min時，吸附率下降到66.04%，此后吸附率隨上樣流速的增加而下降平緩，考慮到吸附穩(wěn)定性，故選擇上樣流速為8 mL/min較為合適。

圖3 NKA-9樹脂的泄露曲線

圖4 上樣流速對吸附率的影響

圖5 不同乙醇體積分數(shù)動態(tài)洗脫效果

2.4 洗脫條件對動態(tài)洗脫效果的影響

2.4.1洗脫劑乙醇體積分數(shù) 乙醇是一種較為安全且比較常用的洗脫劑，能夠使樹脂產(chǎn)生溶脹作用，降低樹脂與被吸附物質(zhì)之間的作用力(范德華力或生成氫鍵)，使樹脂上的被吸附物質(zhì)容易解吸下來[16-17]。在洗脫流速5 mL/min時，洗脫劑用量60 mL時，不同的乙醇體積分數(shù)洗脫效果如圖5。從圖5可以看出體積分數(shù)40%、50%、60%乙醇洗脫效果增速較慢，從體積分數(shù)60%乙醇洗脫開始，洗脫液中茶皂素質(zhì)量濃度隨之增加較快，到90%乙醇洗脫時茶皂素質(zhì)量濃度達到最高，可能是乙醇濃度越高，對樹脂的溶脹作用更好，洗脫效果也更好的緣故，從經(jīng)濟角度考慮，選用體積分數(shù)為80%的乙醇作為后續(xù)洗脫條件的研究。

2.4.2洗脫劑用量 在洗脫流速5 mL/min時，洗脫劑用量對洗脫效果的影響見圖6。由圖6可知，體積分數(shù)90%的乙醇只洗脫部分茶皂素，且峰形跟80%乙醇對比較為不對稱，有拖尾現(xiàn)象發(fā)生;反觀80%乙醇洗脫較為集中且峰形對稱，50 mL洗脫劑用量能使洗脫液中茶皂素質(zhì)量濃度達到1.57 g/L，可能是洗脫劑用量50 mL時左右時恰好能把樹脂上吸附的茶皂素洗脫下來，而過多的洗脫劑會稀釋洗脫液中的茶皂素的含量，過少的洗脫劑無法把樹脂上吸附的茶皂素洗脫下來的緣故。因此，選擇體積分數(shù)80%乙醇進行動態(tài)洗脫，用量為50 mL。

圖6 NKA-9型樹脂的動態(tài)解吸曲線

圖7 不同洗脫流速對洗脫效果的影響

2.4.3洗脫流速 用80%乙醇作為洗脫劑，在不同洗脫劑用量的情況下，3種洗脫流速的實驗結(jié)果見圖7。3種洗脫流速、洗脫效果都是隨洗脫劑用量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，洗脫劑用量50 mL最好，與2.4.2節(jié)實驗結(jié)果一致；流速10 mL/min時洗脫有拖尾現(xiàn)象發(fā)生;流速15 mL/min時峰形略寬，洗脫不徹底。綜合來看，洗脫流速5 mL/min時最佳。在以體積分數(shù)80%乙醇，洗脫流速5 mL/min，用量50 mL進行洗脫，洗脫液中茶皂素質(zhì)量濃度為1.25 g/L，洗脫液經(jīng)干燥得茶皂素純品純度95%。

李明靜等[18]和曹萬新等[19]對大孔吸附樹脂法和傳統(tǒng)的有機溶劑萃取法進行比較研究發(fā)現(xiàn)工藝較為簡單，得到的茶皂素產(chǎn)品顏色淺，純度在90%左右，這和本研究的結(jié)果基本一致，且本研究純化得到的茶皂素純度更高，為95%。因此NKA-9大孔樹脂是一種比較好的純化茶皂素樹脂。

3 結(jié) 論

3.1采用茶籽餅為原料，乙醇為提取劑，提取茶皂素的最佳工藝條件為料液比1∶9(g ∶mL)，乙醇體積分數(shù)60%，提取溫度60 ℃和提取時間為3 h,在此條件下提取得率14.9%。

3.2采用大孔吸附樹脂NKA-9對茶皂素粗品靜態(tài)吸附實驗表明：在0.5 h之內(nèi)，樹脂基本達到飽和，說明NKA-9大孔樹脂是一種快速吸附型樹脂；吸附時間3 h時，吸附量可達到10.73 mg/g，表明樹脂的吸附效果較好。用80%體積分數(shù)的乙醇進行解吸實驗解吸率最大能達到91.1%，表明NKA-9樹脂具有良好的洗脫性能。

3.3對NKA-9樹脂的動態(tài)吸附與解吸進行研究，實驗表明進行動態(tài)吸附時NKA-9樹脂上樣量125 mL和上樣流速8 mL/min較佳，吸附率為66.04%。洗脫實驗結(jié)果表明：洗脫時以體積分數(shù)80%乙醇、乙醇用量50 mL進行洗脫，洗脫流速為5 mL/min時效果較好，這時洗脫液中茶皂素質(zhì)量濃度在1.25～1.57 g/L之間，洗脫液經(jīng)干燥得茶皂素純品純度為95%。