離子色譜法測毛竹竹葉單糖和糖醛酸組成

張 強, 季紅福, 周 燕, 范 煜, 葛 青, 肖竹錢, 毛建衛(wèi)

(浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學與生物加工技術重點實驗室,浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造 協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江科技學院 生物與化學工程學院, 浙江 杭州 310023)

木質(zhì)纖維原料是地球上最豐富的可再生生物質(zhì)資源，主要包括木材、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄物、林產(chǎn)加工廢棄物及各類能源植物。木質(zhì)纖維原料主要由纖維素(22%～42%)、半纖維素(12%～27%)和木質(zhì)素(11%～30%)3部分組成[1]。通過對纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的有效轉化，可高選擇性制備呋喃類化合物[2]、有機酸[3-4]、C5～C6糖及糖醇[5-6]、C2～C3多元醇[7]和液態(tài)烴[8-9]等化學品和燃料。功能性C5～C6糖和糖醇則來源于纖維素和半纖維素，主要包括葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和山梨醇、木糖醇等。中國是竹資源大國，種植規(guī)模和總產(chǎn)量均居世界首位。竹類是重要的可再生資源，竹葉、竹枝和竹稈都有十分廣闊的應用前景，如厚壁毛竹竹葉中含有大量的木質(zhì)纖維，其中主要成分為半纖維素(32.26%～43.78%)和纖維素(21.89%～33.53%)[10-11]。

目前，關于木質(zhì)纖維水解液中的單糖測定方法主要有氣相色譜法(GC)[12-13]、高效液相色譜法(HPLC)[14-15]、離子色譜法(IC)[16-17]等。氣相色譜法是將單糖與硼氫化鈉進行還原反應，將還原后的單糖與乙酸酐進行乙?；蛊涑蔀橐讚]發(fā)的物質(zhì)進行測定，但衍生化操作復雜，且衍生化的程度不完全使得檢測準確性差、重現(xiàn)性差;液相色譜法主要采用示差折光檢測器，以乙腈和水作為流動相，凡是與流動相折光率不同的組分都有響應，但其靈敏度不高，如果樣品中單糖的純度不高，樣品中的雜質(zhì)可能會掩蓋單糖的峰，因此液相色譜難以滿足實際需要;離子色譜本質(zhì)上是液相色譜的一種，可以進行離子型物質(zhì)的分析與測定，糖類化合物在強堿淋洗液中呈現(xiàn)離子化狀態(tài)，根據(jù)糖類物質(zhì)pKa值的不同，可以在陰離子交換柱上被保留并得到分離。采用脈沖安培檢測器，具有靈敏度高、選擇性高、準確度高和重復性高的特點。

近年來，離子色譜法被廣泛用于單糖的檢測，該法操作簡單、無需衍生化即能分析單糖和低聚糖，靈敏度高，且準確度好[18]。本研究采用Dionex ICS-5000+系統(tǒng)，以CarboPACTMPA10(4.0 mm×250 mm)陰離子交換柱為分離柱，脈沖安培檢測器進行檢測，利用梯度洗脫方法，同時考察了色譜柱溫度、NaOH濃度和流速對各種單糖分離的影響。對7種常見的單糖和2種糖醛酸進行了分離與定量分析方法學的研究，建立了同時定量分析7種常見的單糖和2種糖醛酸的方法，利用該方法對磷鎢酸加酶處理后的竹葉單糖組成進行了測定。

1 實 驗

1.1 材料、試劑與儀器

一年生新鮮嫩毛竹竹葉(去除黃葉、爛葉)，2018年9月10日采自浙江科技學院；鼠李糖、巖藻糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、葡萄糖醛酸和磷鎢酸標準品，阿拉丁公司；果膠酶和木聚糖酶，山東隆大生物有限公司;半乳糖醛酸、氫氧化鈉和乙酸鈉，均為色譜純。

Dionex ICS-5000+離子色譜儀、電化學檢測器(Au為工作電極，Ag/AgCl為參比電極)、Heraeus Multifuge X1R離心機，美國賽默飛世爾科技公司；UNIQUE-LC多功能超純水系統(tǒng)，廈門銳斯捷科學儀器有限公司；水熱反應釜，上?；敉嶒瀮x器有限公司。

1.2 色譜條件及優(yōu)化

1.2.1色譜條件 CarboPACTMPA10 (4.0 mm×250 mm)陰離子交換柱,CarboPACTMPA10 (4.0 mm×50 mm)保護柱,電化學檢測器以及四電位波形(清洗電極、提高檢測靈敏度)。梯度淋洗程序：0～30 min,2.5%200 mmol/L NaOH和5% 200 mmo/L CH3COONa混合洗脫；30.1～53 min,50%200 mmol/L NaOH和50% 200 mmol/L CH3COONa混合洗脫；53.1～56 min,100% 200 mmol/L NaOH洗脫；56.1～60 min, 100% 200 mmol/L NaOH洗脫。

1.2.2色譜條件優(yōu)化 按1.2.1節(jié)中的色譜條件，依次對淋洗液NaOH濃度(30、25、20、15、10、5和2.5 mmol/L)、淋洗液的流速(0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1 mL/min)和色譜柱溫度(20、25、30、35和40 ℃)進行優(yōu)化。

1.3 方法學研究

1.3.1標準溶液的制備 由于建立標準曲線和確認單糖出峰時間的需要，分別精密稱取鼠李糖、巖藻糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸標準品各10 mg，置于100 mL容量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的混合標準溶液。用移液槍分別移取10、50、100、300、500、700和900 μL置于10 mL容量瓶中，加超純水稀釋至刻度。制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1、3、5、7和9 mg/L的混合標準溶液，制備9 g/L的各個單糖標準溶液。

1.3.2線性關系考察 取1.3.1節(jié)儲備的標準溶液，稀釋成質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1、3、5、7和9 mg/L的混合標準溶液。按1.2.2節(jié)優(yōu)化后色譜條件進行測定。測定7個濃度的各標準溶液，以峰面積Y為縱坐標，質(zhì)量濃度X為橫坐標進行線性回歸，繪制每種單糖和糖醛酸的標準曲線，得到線性方程。

1.3.3檢測限與定量限的考察 檢測限：分析方法在規(guī)定的實驗條件下所能檢出被測組分的最低濃度;定量限：分析方法可定量測定被測組分中的最低濃度。將5 mg/L 混合對照品溶液逐步稀釋，取25 μL 注入色譜儀，根據(jù)信噪比(S/N)3計算儀器檢測限和S/N 10計算儀器定量限。

1.3.4精密度和重復性的考察 取質(zhì)量濃度為9 mg/L混合對照品溶液，按1.3.1節(jié)色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，測定各標準品的峰面積，得到7種單糖和2種糖醛酸峰面積和保留時間的相對標準偏差(RSD)，根據(jù)方法學定量分析要求RSD需小于3%，以此考察儀器的精密度和重復性。

1.4 樣品溶液的制備及檢測

1.4.1樣品溶液的制備 將新鮮采摘的竹葉洗凈后，在50 ℃烘箱中烘干，進行機械粉碎，過0.45 mm篩子，備用。稱取1 g竹葉粉加入20 mL 3.5%磷鎢酸，150 ℃反應2 h，取出冷卻，用磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值至5，分別加入100 μL果膠酶和木聚糖酶，在50 ℃下酶解7 h，8 000 r/min離心20 min中，抽濾，將提取液定容到50 mL容量瓶中。取100 μL定容到50 mL容量瓶中，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾后按1.2.1節(jié)色譜條件進樣分析。通過比較樣品和標品的出峰時間，確定竹葉水解液中單糖的組成。根據(jù)竹葉水解液中單糖的峰面積和各個單糖的標準曲線，計算出竹葉水解液中單糖的濃度。

1.4.2加標回收率的考察 以樣品中各個單糖的濃度為基準，分別加入1、2和4 mg/L 3個加標水平，每組試驗重復3次，計算回收率以及RSD。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1淋洗液濃度 淋洗液的濃度是影響分離效果的重要因素。調(diào)節(jié)0～30 min內(nèi)淋洗液NaOH的濃度分別為30、25、20、15、10、5和2.5 mmol/L，在糖分析柱上分析含有巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的混合標準品溶液。在NaOH溶液的濃度為30、25、20、15和10 mmol/L范圍內(nèi)，葡萄糖和木糖2個峰有部分重疊，無法分離完全；當NaOH濃度降低為5 mmol/L 時，各個物質(zhì)的峰均能得到較好的分離；當NaOH濃度降低為2.5 mmol/L時，各個物質(zhì)的峰均能分離，但是出峰時間進一步的延長同時峰形更寬。因此選用5 mmol/L NaOH溶液作為淋洗液。

2.1.2淋洗液流速 改變淋洗液流速對出峰時間以及保留時間都有影響，若降低流速，則保留時間明顯延長;若增加流速，則糖的分離效果隨著流速增加變化較大。考察了淋洗液流速在0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1 mL/min范圍內(nèi)變化對分離效果的影響情況，結果發(fā)現(xiàn)：流速為0.5 mL/min時,出峰時間延后，保留時間過長，且峰形不好看;當流速為1 mL/min時出峰時間提前,保留時間縮短,分離度不夠好。綜合考慮，發(fā)現(xiàn)流速為0.8 mL/min時各組分的分離度和峰形最佳，故選擇0.8 mL/min作為淋洗液流速。

2.1.3柱溫 柱溫是離子色譜分析的重要參數(shù)，會直接影響到單糖的分離度和組分的保留時間。將色譜柱溫度分別設定為20、25、30、35和40 ℃，考察不同柱溫對各個單糖分離效果的影響。發(fā)現(xiàn)當柱溫為20 ℃時，各個單糖組分均實現(xiàn)基線分離。但是隨著溫度進一步的升高，發(fā)現(xiàn)單糖色譜峰出現(xiàn)重疊、分離度變差,故最終選擇20 ℃為最佳柱溫。

1.巖藻糖fucose; 2.鼠李糖rhammose; 3.阿拉伯糖arabinose;4.半乳糖galactose; 5.葡萄糖glucose; 6.木糖xylose; 7.果糖fructose; 8.半乳糖醛酸galacturonic acid;9.葡萄糖醛酸glucuronic acid

最終確定測定單糖最佳的離子色譜條件為：淋洗液NaOH濃度為5 mmol/L，淋洗液的流速為0.8 mL/min，柱溫為20 ℃。以優(yōu)化后的最佳條件為色譜條件對1.3.1節(jié)制備的7種單糖及2種糖醛酸的單一標準溶液和混合標準溶液進行分析檢測，結果如圖1所示。根據(jù)單標溶液判斷出各個單糖的出峰時間，結合圖1可知，7種單糖及2種糖醛酸的出峰順序為：巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。當分離度等于1時，相鄰兩峰基本分離;當分離度大于1.5說明相鄰組分完全分離，由表1可知9種標準品的平均分離度都大于1.9，同時，根據(jù)方法學定量分析的要求分離度的RSD均小于3，說明這7種常見單糖及兩種糖醛酸的標品得到較好的分離且重復性較好。與柴銀等[16]的離子色譜檢測多糖中的單糖組成的研究相比，本研究方法可以使半乳糖、葡萄糖和木糖實現(xiàn)完全分離。

表1 各單糖和糖醛酸分離度(9 mg/L)

1)RSD:相對標準偏差relative standard deviation

2.2 方法學研究

2.2.1線性范圍、檢測限(LOD)及定量限(LOQ) 取不同濃度的7種單糖及2種糖醛酸的混合標準溶液重復進樣6次，考察其線性范圍、檢測限(LOD)及定量限(LOQ),結果如表2所示。以各單糖的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，以其對應的峰面積(Y)為縱坐標，作圖得到相應的線性方程。由表2可知，巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖的線性范圍為0.1～9 mg/L，果糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸線性范圍為0.5～9 mg/L。7種單糖及2種糖醛酸的線性方程的R2最小值為0.999 0，檢測限范圍0.01～1 mg/L，定量限范圍0.05～3 mg/L，代表該范圍內(nèi)此方法具有良好的線性關系。

2.2.2精密度和重復性結果 取9 mg/L的標準混合溶液重復進樣6次，通過考察峰面積和出峰時間考察其精密度和重復性。由表3可知標準品峰面積的相對標準偏差(RSD)在0.31%～0.92%內(nèi)(n=6)，標準單糖保留時間的RSD在0.02%～0.80%內(nèi)(n=6)。朱松等[19]采用高效陰離子色譜法檢測了醬油中的單糖及雙糖，在離子色譜儀相同且色譜柱優(yōu)于本研究的條件下，檢測方法中的RSD(1.4%～4.0%)高于本研究,且只分離出7種單糖標品。對比說明本研究的方法精密度高、重復性好。

表2 7種單糖及2種糖醛酸的線性回歸方程及其參數(shù)

表3 7種單糖和2種糖醛酸峰面積和保留時間

1.阿拉伯糖arabinose; 2.半乳糖galactose; 3.葡萄糖glucose; 4.木糖xylose

2.3 樣品的檢測及加標回收率結果

2.3.1樣品的檢測 運用建立的高效陰離子色譜分析方法，對竹葉水解液進行單糖組成檢測，如圖2所示。竹葉水解液中4種單糖可完全分離，與圖1中9種標準品色譜圖保留時間對照可得，竹葉水解液是由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖組成，原料竹葉水解液中相應單糖的質(zhì)量濃度分別為1.77、0.53、5.90和5.84 mg/L，以及相應單糖的質(zhì)量分數(shù)為4.42%、1.34%、14.76%和14.60%。由此計算得竹葉水解液中相應單糖的物質(zhì)的量比為n(阿拉伯糖)∶n(半乳糖)∶n(葡萄糖)∶n(木糖)=2.9 ∶0.7 ∶8.2 ∶9.7。

2.3.2加標回收率結果 將樣品按1.4節(jié)方法進行預處理，稀釋一定倍數(shù)后通過優(yōu)化后的色譜條件對其進行分析。由表4可知，其加標回收率為98.53%～118.63% 均符合方法學定量要求(加標回收率范圍80%～120%)，RSD為0.04%～1.16%(RSD均小于3%)，說明本方法用于實際樣品測定時也具有較高的準確性。

3 結 論

為測定竹葉水解液中的單糖組成，建立了離子色譜-脈沖安培法測定巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的方法。采用單因素試驗對色譜條件進行了優(yōu)化，研究結果表明：當NaOH濃度為5 mmol/L、淋洗液流速為0.8 mL/min、柱溫為20 ℃時，7種單糖和2種糖醛酸可以完全分離。根據(jù)單糖和糖醛酸的pKa值的不同，通過改變條件使其達到良好的分離效果，與其它色譜檢測方式具有更優(yōu)越的準確度、精密度、靈敏度，且整個分析過程操作簡單易行。研究發(fā)現(xiàn)7種單糖及2種糖醛酸的線性范圍、檢測限、定量限、精密度及樣品的加標回收率均較為良好。同時，將建立的檢測方法用于檢測了毛竹竹葉水解液中的單糖組成，結果表明：竹葉水解液是由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖組成，相應單糖的質(zhì)量濃度分別為1.77、0.53、5.90、5.84 mg/L，相應單糖的質(zhì)量分數(shù)為4.42%、1.34%、14.76%、14.60%，相應單糖的物質(zhì)的量比為2.9∶0.7∶8.2∶9.7。說明該方法可用于木質(zhì)纖維基單糖的檢測。

表4 不同加標濃度下分析物回收率及相對標準偏差(n=3)