中華鱉GHITM cDNA基因克隆及表達分析*

熊 鋼 周先文 馬 曉 曾 丹 陳貞年 康 驪 王曉清

中華鱉cDNA基因克隆及表達分析*

熊 鋼1,2周先文2馬 曉3曾 丹2陳貞年2康 驪1王曉清2①

(1. 湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學院動物科技系 長沙 410127；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 長沙 410128；3. 河南師范大學水產(chǎn)學院 新鄉(xiāng) 453007)

為研究基因在中華鱉()胚胎發(fā)育及生長中的作用，本研究通過RT-PCR和RACE方法獲得了中華鱉全長cDNA序列；采用實時熒光定量PCR對mRNA組織表達及不同溫度孵化胚胎發(fā)育過程中的表達特性進行分析。結(jié)果顯示，中華鱉cDNA序列長度為2650 bp，開放閱讀框為1050 bp，5￠非編碼區(qū)為123 bp，3￠非編碼區(qū)為1477 bp，編碼349個氨基酸，編碼蛋白的等電點為10.01，分子量為37.12 kDa。編碼氨基酸序列由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成，7個跨膜域組成跨膜區(qū)。編碼氨基酸序列的同源性分析顯示，中華鱉與錦龜()和綠海龜()同屬一個分支，3種鱷魚構(gòu)成一個分支，7種鳥類形成一個分支。實時熒光定量檢測顯示，基因在肝臟、肌肉和腦垂體中的表達水平較高，顯著高于心臟、性腺、腸、腎臟和脾臟組織(<0.05)；50 g左右和500 g左右雄性個體肝臟中的基因表達量顯著高于雌性個體(<0.05)；低溫脅迫孵化能顯著抑制胚胎肝臟中基因的表達(<0.05)。上述研究結(jié)果表明，基因與中華鱉生長和胚胎發(fā)育密切相關(guān)，其在中華鱉胚胎中的表達受孵化溫度調(diào)節(jié)。本研究為探討中華鱉胚胎發(fā)育和生長提供理論依據(jù)。

中華鱉；；基因克??；胚胎發(fā)育；組織表達

生長激素誘導的跨膜蛋白(Growth-hormone inducibletransmembrane protein, GHITM)是在研究轉(zhuǎn)基因(Growth- hormone antagonist, GHA)小鼠的差異表達基因時被首次發(fā)現(xiàn)(Li, 2001)。GHITM蛋白(Reimers, 2007)的氨基酸序列其C末端的特殊結(jié)構(gòu)域，將其歸類為Bax抑制蛋白類似家族新成員，BI-1家族(Bax inhibitory protein-like family)在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中高表達，并且參與細胞的程序性細胞死亡。這些家族成員在哺乳動物中保守存在，都是定位于細胞膜上且具有6~ 7個典型跨膜結(jié)構(gòu)域的高疏水性蛋白(羅少杰等, 2016)，在軟體動物仿刺參() (高楊等, 2014)和馬氏珠母貝() (羅少杰等, 2016)中有8個跨膜結(jié)構(gòu)，因而得名生長激素誘導的跨膜蛋白。

GHITM蛋白在氧自由基對抗衰老的機制中發(fā)揮作用，與動物的年齡、生長相關(guān)(Knapp, 1994)。GHITM在小鼠胚胎和成人組織以及哺乳動物組織中普遍存在表達，在小鼠胚胎發(fā)育過程中大量表達，胚胎分裂對GHITM表達量至關(guān)重要(Yoshida, 2006)。GHITM在日本血吸蟲() (熊濤等, 2012)童蟲時期表達量高，推測其在生長發(fā)育中發(fā)揮作用。

為探討中華鱉胚胎發(fā)育和生長，本研究采用RACE (Rapid-amplification of cDNA ends)擴增法獲得中華鱉cDNA的全長序列，并采用實時熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)檢測基因的組織表達情況，及不同孵化溫度對胚胎處理的研究，旨在為進一步探討中華鱉基因的生物學功能及作用機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

從湖南省岳陽市臨湘中華鱉養(yǎng)殖場采集同批次50 g左右和500 g左右的中華鱉雌雄個體各3個，取其肌肉、肝臟、腦垂體、腸道、心臟、脾臟和性腺組織。中華鱉受精卵取自湖南省常德柳葉湖河州甲魚生態(tài)養(yǎng)殖基地，24℃、30℃和34℃恒溫孵化，取15~17期、20~22期和破殼期胚胎肝臟組織，各組織放入1.5 ml離心管中，于液氮中冷凍后，-80℃保存。

1.2 主要藥品與試劑

RNA提取試劑盒(RNAiso Plus)、柱式膠回收試劑盒和凝膠回收試劑盒購于Omega，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0、純化試劑盒和TdT酶購自大連寶生物工程(TaKaRa)公司，PCR反應酶-2×EasyTaq PCR SuperMix (北京全式金生物)、SYBR Green real time PCR Mix購自Thermo Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物合成 從GenBank中下載相近物種的基因序列，在基因保守區(qū)內(nèi)用Primer Premier 5.0設計特異性引物，引物由上海鉑尚生物科技有限公司(以下簡稱鉑尚生物)合成，引物序列見表1。

1.3.2 總RNA提取和cDNA合成 用RNA提取試劑盒(Omega)提取總RNA，加入30 μl Rnase-free 水，60℃孵化溶解RNA沉淀，–20℃保存?zhèn)溆?。以提取的總RNA為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄成第一條cDNA鏈。

表1 中華鱉cDNA序列擴增及RT-PCR用引物

Tab.1 Primers used for cloning of GHITM cDNA and RT-PCR

1.3.3cDNA中間片段擴增和克隆 以引物GHITM1+和GHITM1擴增基因中間片段1；GHITM2+和GHITM2-擴增GHITM基因中間片段2；PCR擴增條件：95℃預變性3 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 60 s，共33個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳、切膠和回收純化后克隆至pGM-T載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)TOP10，進行藍白斑篩選，菌液PCR檢測陽性克隆，陽性克隆送鉑尚生物測序。

1.3.4cDNA 3￠端和5￠端片段擴增和克隆 3￠端片段擴增和克隆：擴增采用GHITM2+、GHITMN3￠、3￠RACE Olig(T)-Adaptor和3￠RACE Adaptor引物，作為巢式PCR引物，GHITMN3￠是根據(jù)已獲得中間片段序列而設計的特異性引物，并且GHITMN3￠在GHITM2+的下游；3'RACE Olig(T)-Adaptor和3￠RACE Adaptor是1對通用引物。反轉(zhuǎn)錄時，用3￠RACE Olig(T)- Adaptor代替反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的Olig(T)用于mRNA反轉(zhuǎn)錄；擴增時，采用GHITM2+和3￠RACE Adaptor進行第1次PCR：94℃預變性3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，共20個循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物稀釋50倍后，用GHITMN3￠和3￠RACE Adaptor進行巢式PCR，反應條件同上。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳，將出現(xiàn)的條帶切膠和回收純化后克隆至pGM-T載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)TOP10，進行藍白斑篩選，菌液PCR檢測陽性克隆，陽性克隆送鉑尚生物測序。

5￠端片段擴增和克?。簲U增采用GHITM1-、GHITMN5￠、5￠RACE Olig(T)-Adaptor和5￠RACE Adaptor引物，GHITMN5￠為根據(jù)已獲得中間片段序列而設計的特異性引物，并且GHITMN5￠在GHITM1-的上游；5￠RACE Olig(T)- Adaptor和5￠RACE Adaptor為1對通用引物。首先，用特異性引物GHITM1-代替反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的Olig(T)，在Mulv逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈，用DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0 (Code: DV807A)純化試劑盒將cDNA純化。然后，在純化產(chǎn)物cDNA3￠端加1個Poly(A)尾巴。取純化cDNA 10.0 μl，5×TdT buffer 10 μl，0.1% BSA 5.0 μl，dATP (10 mmol/L) 2.5 μl，TdT酶1.0 μl，H2O 21.5 μl，37℃保溫30 min后80℃10 min，產(chǎn)物用H2O稀釋為0.5 ml后–20℃保存?zhèn)溆谩Ｗ詈笥肎HITM1-和5'RACE Olig(T)-Adaptor進行第1次PCR：94℃預變性3 min；94℃ 30 s，53℃ 30s，72℃ 60 s，共20個循環(huán)；72℃延伸10 min，產(chǎn)物稀釋50倍后再用GHITMN5'和5' RACE Adaptor進行巢式PCR，反應條件同上。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳，將出現(xiàn)的條帶切膠和回收純化后克隆至pGM-T載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)TOP10，進行藍白斑篩選，菌液PCR檢測陽性克隆，陽性克隆送鉑尚生物測序。

1.3.5 測序結(jié)果分析 測序結(jié)果在美國基因庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析，主要使用DNAMAN生物軟件、開放閱讀框(https://www.ncbi.nlm. nih.gov/orffinder/)，蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預測使用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)在線軟件，信號肽(http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、CLC Main workbench軟件和SWISS-MODEL Workspace (http://swissmodel. expasy.org/interactive)在線進行分析。應用MEGA 6.06(Librado, 2009)軟件，采用鄰位相接法(NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用Bootstrap重復1000次計算各分支的置信度。

1.3.6 基因發(fā)育及組織表達檢測 按1.3.3方法獲得中華鱉心臟、肝臟、肌肉、性腺、腸、腎臟、腦垂體、脾臟和胚胎肝組織cDNA，每個組織取3個平行樣，其中，雌雄中華鱉胚胎用本課題組篩選的中華鱉性染色體PCR引物進行鑒定，50 g左右和500 g左右中華鱉雌雄采用解剖肉眼觀察篩選。用熒光定量引物Real-GHITM和內(nèi)參引物對各組織進行基因表達檢測。對熒光定量數(shù)據(jù)采用基因相對內(nèi)參基因表達量(2-ΔΔCt)進行計算。實驗結(jié)果采用SPSS 17.0進行ANOVA單因素方差分析(One-way ANOVA)，<0.05為顯著差異，<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 GHTIM cDNA克隆及序列分析

以中華鱉肝臟RNA為模板，用特異性引物擴增獲得cDNA，全長為2650 bp(基因號: MH557794)，包括包含123 bp的5￠非編碼區(qū)序列、1 477 bp的3￠非編碼區(qū)序列、長度為1050 bp開放閱讀框，編碼349個氨基酸(圖1)，編碼蛋白的等電點為10.01，分子量為37.12 kDa。

2.2 基因編碼氨基酸序列生物信息分析

利用SignalP軟件對基因編碼氨基酸序列預測無明顯信號肽。編碼蛋白功能域預測發(fā)現(xiàn)，基因編碼氨基酸序列為典型的7個跨膜結(jié)構(gòu)蛋白(圖2)。從第121個氨基酸開始跨膜，由20個氨基酸組成的第4個跨膜結(jié)構(gòu)域長度最短，由31個氨基酸組成的第7個跨膜結(jié)構(gòu)域長度最長。

2.3 系統(tǒng)進化樹分析

在GenBank中對中華鱉基因BLAST獲得錦龜(, XP_005294095.1)、墨西哥箱龜(, XM_024209991)、綠海龜(, XP_007067303.1)、灣鱷(, XM_019555975)、揚子鱷(, XP_006029557.1)、密西西比鱷(, XP_006270235.1)、非洲鴕鳥(, XM_009685550)、褐幾維鳥(, XM_013961508)、日鳽(, XM_010148176)、暴雪鹱(, XM_009578185)、鵑鴗(, XM_009958645)、日本冠鹮(, XM_009465931)和帝企鵝(, XM_019473032)物種的基因。利用MEGA 6.06軟件對14個物種基因編碼氨基酸序列進行比對并構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果顯示，鱉科的中華鱉與龜科的錦龜和海龜科的綠海龜親緣關(guān)系最近，同屬一個分支，澤龜科的墨西哥箱龜獨立在一支，灣鱷、揚子鱷和密西西比鱷3種鱷魚構(gòu)成一分支，7種鳥類形成一分支。

圖1 中華鱉GHITM cDNA序列和推測的氨基酸序列

下畫線表示跨膜結(jié)構(gòu)域

Underline represents the transmembrane domain

圖2 GHITM編碼蛋白功能域預測

Fig.2 Prediction of protein functional domains of GHITM

圖3 利用MEGA 6.06軟件構(gòu)建的基于GHITM基因所編碼氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進化樹

2.4 GHITM基因的組織表達特性及胚胎發(fā)育階段變化

采用相對實時定量PCR檢測mRNA的組織和胚胎表達特性，結(jié)果顯示，基因在500 g左右中華鱉的肝臟、肌肉和腦垂體中表達水平較高，顯著高于心臟、性腺、腸、腎臟和脾臟組織(<0.05)，在性腺中表達量最低，且精巢與卵巢的表達量差異不顯著(>0.05)；50 g左右和500 g左右雄性中華鱉肝臟中表達量顯著高于雌性(<0.05)；采用30℃孵化的中華鱉胚胎性別決定期和分化期的雄性胚胎肝臟表達量不顯著高于雌性(>0.05)，在胚胎破殼時，雌性個體肝臟組織不顯著高于雄性(>0.05)；經(jīng)24℃低溫脅迫孵化處理胚胎肝臟能顯著降低表達量(<0.05)，34℃高溫脅迫孵化處理不能顯著增加表達量(>0.05)。

圖4 中華鱉組織GHITM基因相對表達量

“*”代表組織間差異顯著(=3,<0.05)，下同

“*”represents significant difference between groups (=3,<0.05). The same as below

圖5 中華鱉肝臟GHITM基因相對表達量

3 討論

GHITM在調(diào)節(jié)GH功能、胚胎發(fā)育、脂肪代謝和免疫等許多方面有重要功能。人類Bax抑制因子和BI-1蛋白在跨膜區(qū)有6~7個跨膜域，在進化過程中是一個保守且具有復雜結(jié)構(gòu)的蛋白，主要存在于胞漿中，作為細胞損傷和刺激的傳感器等(Reimers, 2007)。本研究中的4種鱉龜GHITM蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域均為7個，其基因編碼氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹與物種傳統(tǒng)分類地位一致。

在動物生長及能量代謝方面具有重要作用。表達量與小鼠胚胎分裂關(guān)系緊密(Yoshida, 2006)。在生長方面，雞有調(diào)控生長的作用，是B淋巴細胞的特異性基因之一(Koskela, 2003)。介導生長激素/胰島素樣生長因子1軸 (GH/IGF1)對動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)保護作用(Baudet, 2008)。羅非魚的(Qiang, 2017)在小分子RNA(miR-1338-5p)的調(diào)節(jié)下參與干擾生長激素(GH)–生長激素受體(GHT)–胰島素樣生長因子(IGF)信號通路，參與羅非魚的生長和發(fā)育。中華鱉雌雄個體在生長過程中存在差異，雄性中華鱉生長速度顯著高于雌性(馬曉等, 2015)。本研究選取快速生長階段中的50 g左右和500 g左右中華鱉為研究材料，結(jié)果表明，500 g左右中華鱉基因在肝臟中表達量高于50 g左右中華鱉，據(jù)此推斷，基因參與了中華鱉生長調(diào)節(jié)。

此外，GHITM (Henke, 2011)通過細胞內(nèi)鈣內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持線粒體的正常結(jié)構(gòu)。LPS刺激誘導仿刺參體腔細胞發(fā)現(xiàn)GHITM(高楊等, 2014)參與了仿刺參抗細菌感染和天然免疫防御反應。本研究發(fā)現(xiàn)，脾臟中GHITM有較高的表達量，其是否參與中華鱉的免疫尚需進一步研究。

在小鼠(Li, 2001)的胚胎發(fā)育過程中，含量不斷增加，且在心、肝、肌、胃、腎、腦中均表達量較高。東方蜜蜂()的能夠協(xié)同PGDR參與蛻皮和變態(tài)過程，在工蜂幼蟲中基因表達隨日齡穩(wěn)定增長，而蜂王蛹中該基因的表達模式為先下降后上升(龔志文等, 2016)。半滑舌鰨()GH/IGF-Ⅰ軸(徐永江等, 2017)對卵巢發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。在中華鱉胚胎發(fā)育階段，孵化溫度與孵化性別(巫旗生等, 2011)和胚胎重量存在相關(guān)性。本研究中，低溫孵化處理對中華鱉胚胎基因表達量有顯著抑制作用，高溫孵化處理對其表達有上調(diào)作用，而在胚胎發(fā)育性別分化期(20~22期)基因表達量有所下降，這表明參與了中華鱉胚胎發(fā)育，但是否協(xié)同中華鱉性別調(diào)控還需進一步證實。綜上所述，本研究是鱉龜類基因研究的首次報道，為進一步研究中華鱉胚胎發(fā)育和生長提供理論依據(jù)。

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Molecular Cloning and Expression Analysis ofcDNA in

XIONG Gang1,2, ZHOU Xianwen2, MA Xiao3, ZENG Dan2, CHEN Zhennian2, KANG Li1, WANG Xiaoqing2①

(1. Department of Animal Science and Technology, Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic, Changsha 410127; 2. College of Animal Science and Technology, Hunan Agriculture University, Changsha 410128; 3. College of Fisheries, Henan Normal University, Xinxiang 453007)

In this study, we obtained the full-length cDNA of thegene fromfor the first time using the RACE (rapid-amplification of cDNA ends) method. The full-length cDNA sequence was 2650 bp, including a 123 bp 5￠-UTR, 1477 bp 3￠-UTR, and 1050 bp open reading frame (ORF) that encoded 349 amino acid residues. The isoelectric point (pI) of this peptide was 10.01, and the molecular mass was 37.12 kDa. The amino acid sequence was composed of the extracellular region, the transmembrane region, and the intracellular region. The transmembrane region was composed of 7 transmembrane domains. The phylogenetic analysis of the amino acid sequences showed that,andbelonged to the same branch, the three species of crocodiles formed a branch, and birds formed another branch. The expression ofin different tissues was also analyzed with quantitative real-time PCR. The results showed thatwas expressed in all the tested tissues, including the liver, pituitary, muscle, spleen, kidney, heart, intestine, and gonad, with the high expression observed in the liver, muscle, and pituitary. At the specifications of 50 g and 500 g, the expression ofwas significantly higher in the liver of males than females (<0.05). Low temperature incubation can inhibit the expression ofin fetal embryos (<0.05). The results indicated thatwas related to the growth and embryo development of

;; Gene cloning; Embryonic development; Tissue expression

S917；Q575；Q492

A

2095-9869(2019)06-0173-07

10.19663/j.issn2095-9869.20180906001

http://www.yykxjz.cn/

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* 國家自然科學基金(31672640)、湖南省自然科學基金(2017JJ3134; 2016NK2115)和湖南省教育廳基金項目(17C0935)共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31672640), Natural Science Foundation of Hunan Province(2017JJ3134; 2016NK2115), and Scientific Research Fund of Hunan Province Education Department(17C0935)]. 熊 鋼，E-mail: xionggang709@126.com

王曉清，教授，E-mail: wangxiao8258@126.com

2018-09-06,

2018-10-21

WANG Xiaoqing, E-mail: wangxiao8258@126.com

(編輯 馮小花)