IGF-1/IGF-1R在大鼠梗死心肌組織中的表達與干預

于俊民，張小波，李大鶴，王慧冬，趙園園，沈偉偉

胰島素樣生長因子（IGF-1）是重要的心源性激素，參與機體整個動脈粥樣硬化形成過程。IGF-1通過與分布體內多種組織、器官的胰島素樣生長因子-1受體（IGF-1R）結合，在冠心病、內分泌疾病、惡性腫瘤及肝、腎、心肌纖維化等疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。心肌纖維化（MF）是由于心肌膠原纖維過量沉積及比例失調最終導致心功能不全的一種病理變化，是心肌梗死后惡性心律失常的關鍵影響因素[1]，如何調控MF的發(fā)展進程，對于改善心肌梗死（MI）預后具有重要的臨床意義。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）在改善梗死后心肌纖維化方面的作用已得到證實，前期研究發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦可影響老年非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）患者血中TGF-β1、CTGF的水平[2]，但厄貝沙坦對心肌梗死患者血中及組織中IGF-1、IGF-1R的影響尚未見報道。實驗通過觀察大鼠心肌梗死后心肌組織中IGF-1、IGF-1R的表達，并給予厄貝沙坦干預，進而探討IGF-1、IGF-1R對心肌梗死預后的影響，為心肌纖維化防治提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料清潔級Wistar雄性大鼠（哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心提供）；實時PCR儀（ABI 7500）；IGF-1、IGF-1R及GAPDH引物（TaKaRa）；RT試劑盒（Promega）；抗IGF-1抗體、抗IGF-1R抗體（Abcam）；抗GAPDH抗體（CST）；裂解液Trizol reagent（Invitrogen）；HRP標記的Ⅱ抗（碧云天）；RIP組織細胞快速裂解液（Solarbio）；BCA蛋白定量試劑盒（Thermo）；NC膜（Millipore）；厄貝沙坦（商品名：安博維；德國賽諾菲制藥公司）。

1.2 心肌梗死模型的制備大鼠稱重，以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，氣管插管后連接小動物呼吸機有氧正壓通氣。于左側胸腔第4肋間逐層開胸，開放心包后擠壓右側胸腔使心臟暴露于胸腔外，用絲線結扎左冠狀動脈前降支后，將心臟放回正常位置，并逐層縫合胸腔?；謴妥灾骱粑蟀喂埽卮淝逍?。假手術組，采用相同的方法開胸、穿線，僅在冠狀動脈下留置絲線，不結扎，余與制模組相同。

1.3 實驗分組選擇建模后24 h存活大鼠隨機分為藥物組（n=9）、對照組（n=9），另設假手術組（n=9）。藥物組給予厄貝沙坦50 mg·kg/d，連續(xù)4周，對照組及假手術組給予等體積生理鹽水灌胃，每天1次，4周后處死。

1.4 大鼠左心室重量測定4周時大鼠稱重，3%戊巴比妥30 mg/kg腹腔麻醉，心腔內注射10%氯化鉀使心臟停跳于舒張期，稱取左心室重量。

1.5 心肌病理改變大鼠心肌組織常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，切片脫蠟，二甲苯透明，蘇木精-伊紅染色（HE）染色，光鏡觀察各組大鼠的心肌組織形態(tài)學變化。

1.6 IGF-1、IGF-1R mRNA檢測應用Real-time PCR方法檢測各組大鼠心肌組織中IGF-1、IGF-1R mRNA水平。提取各組大鼠心肌組織，按照Trizol試劑盒操作步驟進行RNA提取 ，然后反轉錄合成cDNA ，將制備好的cDNA進行PCR擴增，數(shù)據(jù)采用儀器自帶ABI Prism 7300 SDS Software分析。實時定量PCR的數(shù)據(jù)應用2-△△Ct方法計算。

IGF-1的上游引物序列5’-GCACTCTGCTTGCTC ACCTTTA-3’，

下游引物序列為5’-TCCGAATGCTGGAGCCATA-3’；

IGF-1R的上游引物序列為5’-GGTCTCTAAGGC CAGAGGTGGA-3’，

下游引物序列為5’-GACGAACTTGTTGGCATTG AGGTA-3’；

GAPDH的上游引物序列為5’- GGAGATTACTGC CCTGGCTCCTA-3’,

下游引物序列為5’-GACTCATCGTACTCCTGCTT GCTG-3’。

1.7 IGF-1、IGF-1R蛋白檢測將新鮮組織剪成碎片，按每20 mg組織加入150～250 μl裂解液比例加入裂解液，勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃12 000×g離心15 min，取上清，進行蛋白質定量，采用半干式轉膜儀進行轉膜，甲醇活化后用TBST洗后進行封閉。封閉后進行I抗孵育，根據(jù)說明書IGF-1 1:2500、IGF-1R 1:500稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜室溫孵育2 h。孵育I抗的膜用TBST洗滌5 min×3次。隨后根據(jù)用量，按照1:1500稀釋HRP標記的Ⅱ抗，與膜37℃孵育1 h。用TBST洗滌5 min×3次。最后采用ECL化學發(fā)光檢測顯色條帶強弱。以目的蛋白條帶的強度與內參照蛋白強度的比值代表目的蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學處理應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)均以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 心肌病理變化HE染色可見假手術組心肌細胞排列規(guī)則，對照及藥物組心肌細胞排列紊亂，心肌細胞腫脹、斷裂，細胞核溶解，炎性細胞浸潤，藥物組改變較對照組減輕（圖1）。

2.2 大鼠左心室重量各組大鼠體重無統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）；左心室重量的比較中，藥物組和對照組高于假手術組，對照組高于藥物組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）（表1）。

2.3 大鼠心肌組織IGF-1、IGF-1R的mRNA及蛋白表達大鼠心肌組織中均可檢測到IGF-1、IGF-1R的mRNA及蛋白水平。藥物組及對照組IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白含量均高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；藥物組IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2、圖2）。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色（×400）

表1 各組大鼠體重、左心室重量情況

表2 各組大鼠IGF-1、IGF-1R的mRNA及蛋白的表達情況

圖2 大鼠缺血心肌IGF-1、IGF-1R蛋白表達

3 討論

IGF-1作為胰島素家族的一類多肽，是一種多功能細胞增殖調控因子。有學者認為IGF-1參與新生心肌纖維的增殖，在成熟心肌細胞中具有加強心肌纖維生長的功能[3]，同時IGF參與多種心臟生理病理過程，在急性心肌梗死的發(fā)生發(fā)展中有重大意義[4]。胰島素樣生長因子-1受體普遍分布于心血管系統(tǒng)，屬于酪氨酸蛋白激酶傳導系統(tǒng)，由4個亞基組成，主要接受IGF-1的刺激。IGF-1與IGF-1R結合后可激活多種信號通路，對心肌纖維化和心肌肥厚起到調節(jié)作用。

心肌纖維化在心室重構的過程中會導致心肌功能、代謝、傳導異常，發(fā)展成為心力衰竭、心肌疾病及各種心律失常等心臟疾病[5]。心肌梗死后心室重塑、心肌纖維化，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS系統(tǒng)）的激活，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）與血管緊張素轉換酶1（AT1）型受體結合，介導心室重塑過程中一系列生物化學反應。ARB在受體水平完全阻斷血管緊張素作用降低末梢血管阻力，抑制腎上腺分泌醛固酮，改善舒張功能，防止心室重構。心肌梗死后心肌局部AngⅡ增加，導致膠原合成增加，加速心肌纖維化的進程[6]。厄貝沙坦能夠有效抑制AngⅠ向AngⅡ的轉換，同時對AT1也具有特異性拮抗作用[7-9]。

有文獻報道厄貝沙坦可以通過下調基質金屬蛋白酶2（MMP2）、基質金屬蛋白酶抑制因子2（TIMP-2）表達,調節(jié)細胞外基質（ECM）的降解和合成，減輕高血壓導致的心室肌纖維化[10]，在心肌梗死后重構早期階段的抗炎作用可以改善心肌梗死預后[11]，另有報道纈沙坦可以抑制AngⅡ的釋放，降低MMP-2和基質金屬蛋白酶9（MMP-9），從而減少膠原蛋白的累積，防止心肌纖維化的進展[12]，Tang等觀察到糖尿病大鼠經(jīng)厄貝沙坦干預后減輕糖尿病心肌病的損傷程度[13]。本實驗通過建立大鼠心肌梗死模型，給予厄貝沙坦治療4周后發(fā)現(xiàn)藥物組大鼠心肌病理變化明顯改善，且左心室重量明顯低于對照組，證實了厄貝沙坦對心肌梗死后大鼠缺血心肌的保護作用。

Galie等[14]通過對大鼠心肌纖維化模型觀察，發(fā)現(xiàn)缺氧誘導成纖維細胞使IGF-1和血管內皮生長因子分泌顯著增加，以促進缺血心肌形成旁分泌環(huán)境，介導纖維化過程。心肌梗死后心肌缺血性損傷刺激心肌細胞合成炎癥細胞因子，同時梗死心肌釋放多種抗原引發(fā)自身免疫反應促使炎癥發(fā)生。急性炎癥是纖維化的起始，隨后發(fā)生的信號轉導、氧環(huán)境改變等上調纖維化相關基因的表達[15]，有研究發(fā)現(xiàn)炎性因子可促進上皮細胞表達IGF-1、IGF-1R[16]，有學者證實IGF-1介導的信號通路與腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在心室重塑的過程中存在協(xié)同作用[17]。實驗觀察到心肌梗死大鼠應用厄貝沙坦治療4周后，藥物組及對照組大鼠心肌組織中IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白水平明顯高于假手術組，且藥物組IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白明顯低于對照組，表明厄貝沙坦可以調控大鼠梗死心肌組織中IGF-1、IGF-1R mRNA、蛋白表達，抑制IGF-1、IGF-1R水平，從而推測IGF-1、IGF-1R參與了厄貝沙坦對缺血心肌的保護作用。

心肌纖維化已成為研究心肌梗死后心力衰竭的治療靶點。心肌梗死后膠原降解過度，異常膠原沉積，廣泛心肌纖維化使心室壁硬度增加，順應性減低，影響心臟的收縮和舒張功能，最終導致心力衰竭的發(fā)生[18,19]。曾有學者報道高血壓患者外周血IGF-1水平與其心血管重構具有緊密聯(lián)系[20]，充血性心力衰竭時IGF-1介導并參與心肌重構[21]，以往研究證實厄貝沙坦可影響大鼠缺血心肌組織中肝細胞生長因子（HGF）水平[22]，本實驗觀察到厄貝沙坦同時可抑制梗死大鼠心肌組織IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白表達，表明IGF-1/IGF-1R信號通路與其他炎癥因子共同參與了心肌梗死后心室重構心肌纖維化過程，從分子水平為心肌梗死后心肌纖維化機制的研究奠定了基礎，為厄貝沙坦的臨床應用提供理論依據(jù)。由于本實驗樣本量較小，在心肌梗死后心肌纖維化的過程中，是否存在細胞因子與信號通路間的相互影響尚需進一步探討。