左卡尼汀對AMI大鼠心肌細(xì)胞以及對PI3K/Akt/Sirt1信號通路、PDGF、Profilin-1表達(dá)的影響

周慧良，甘受益，馮光瑞，李賓，宋巧巧，劉亮

左卡尼?。ㄗ笮舛緣A）主要存在于心肌和骨骼肌細(xì)胞中，具有促進(jìn)脂代謝和保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[1]。近年來研究顯示聯(lián)合使用左卡尼汀可提高對急性心肌梗死（AMI）患者的臨床效果[2]。由于心肌缺血引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)是引起心肌細(xì)胞凋亡的主要原因，血小板衍生因子（PDGF）具有刺激特定細(xì)胞群分裂增殖的能力，研究顯示PDGF水平與AMI患者預(yù)后相關(guān)[3]。前纖維蛋白-1（Profilin-1）具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，AMI患者血清Profilin-1水平顯著升高[4]。本研究主要探究左卡尼汀對磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）/Sirt1信號通路以及PDGF、Profilin-1表達(dá)的影響并探究其治療機(jī)理，為臨床更好的應(yīng)用左卡尼汀治療AMI提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組45只成年雄性Wistar大鼠45只（Laboratory Animal Cecter，中國），體質(zhì)量250～280 g，隨機(jī)分為對照組（假手術(shù)組）、模型組和左卡尼汀組3組，每組各15只。

1.2 建模方法AMI模型參考董化江等[5]的方法，模型組和左卡尼汀組將大鼠使用水合氯醛（4%）麻醉后迅速打開胸腔暴露心臟，使用6/0線在左心耳下約 2 mm處的冠狀動脈前降支結(jié)扎，關(guān)閉并縫合。對照組常規(guī)打開并閉合胸腔，三組大鼠在建模后均腹腔注射青霉素[30萬單位/（kg·d）]預(yù)防感染，持續(xù)3 d。左卡尼汀組在術(shù)后腹腔注射左卡尼?。ㄥ\州九泰藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字H20041552），劑量為40 mg/kg。注射等量的生理鹽水作為對照。常規(guī)飼養(yǎng)2周，收集尾靜脈全血，處死后收集心臟并于-80 ℃下保存。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）通過檢測大鼠

心肌酶指標(biāo)判斷心肌梗死狀況，并檢測三組大鼠血清中PDGF、Profilin-1表達(dá)水平。將血液靜置后離心（2000 rpm，10 min），使用ELISA檢測大鼠血清樣本中肌鈣蛋白T（cTnT）、肌酸激酶（CK-MB）、PDGF、Profilin-1的濃度。試劑盒購自華美公司（中國武漢）。根據(jù)說明書加入酶標(biāo)記試劑和顯色劑，并通過加入終止溶液終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀（Model 680，Bio-Rad，USA）測定450 nm處的光密度。

1.3.2 細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡檢測大鼠處死后收集心肌細(xì)胞，使用CCK-8法測定細(xì)胞活力，并使用流式細(xì)胞術(shù)用于檢測細(xì)胞凋亡。CCK-8試劑盒購自Tongren公司（日本），將心肌細(xì)胞處理后然后加入10 ml CCK-8試劑并在37℃，5%的CO2中培養(yǎng)4 h。使用酶標(biāo)儀（ELX 800，Bio-Teck，USA）測量每個孔在450 nm處的吸光度。凋亡試劑盒購自BD Pharmingen（USA），按照試劑盒說明書分別加入PE以及7-AAD，應(yīng)用流式細(xì)胞儀（Becton Dickerson，SanJose，CA，USA）檢測和計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 蛋白印跡（Western Blot）使用Western Blot檢測大鼠心肌組織中PI3K、Akt和Sirt1蛋白的表達(dá)水平。細(xì)胞裂解后收集總蛋白并檢測蛋白濃度，使用10%的SDS-PAGE凝膠并用于電泳，電泳后使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（Bio-Rad，USA）并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。加入一抗室溫震蕩2 h，后在4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫下孵育1.5～2 h，使用ECL試劑（Huiying，Shanghai，China）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。使用β-actin作為內(nèi)參。

1.3.4 實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）將心肌組織研磨后使用RNA分離試劑盒分離RNA，然后通過RT-PCR反應(yīng)檢測磷脂酰肌醇-3-羥基酶（PI3K）、蛋白激酶（Akt）和沉默調(diào)節(jié)蛋白A抗原（Sirt1）的mRNA表達(dá)水平。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，Japan）對RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄測定以合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃，反應(yīng)15 min，逆轉(zhuǎn)錄酶失活條件為85℃，反應(yīng)15 s；后進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，通過在95℃下激活DNA聚合酶5 min進(jìn)行PCR，進(jìn)行40個循環(huán)的兩步PCR（95℃/10 s和60℃/30 s），最終延伸75℃10 min，保持在4℃。所有引物均獲自Genewiz（中國江蘇蘇州）公司，使用2-ΔΔCT法分析mRNA表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示，使用單因素方差分析（ANOVA）評估實(shí)驗(yàn)組間的差異，Speaman秩相關(guān)系數(shù)被應(yīng)用于檢測相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組間心肌酶水平比較模型組大鼠血清cTnT和CK-MB水平顯著高于對照組（P＜0.05），左卡尼汀組大鼠血清cTnT和CK-MB水平顯著低于模型組（P＜0.05）（表1）。

2.2 三組細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況比較模型組大鼠心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著低于對照組而凋亡率顯著高于對照組（P＜0.05），左卡尼汀組大鼠心肌細(xì)胞活力顯著高于模型組而凋亡率顯著低于模型組（P＜0.05）（表2）。

2.3 三組PDGF、Profilin-1水平比較模型組大鼠血清PDGF顯著低于對照組而Profilin-1水平顯著高于對照組（P＜0.05），左卡尼汀組大鼠血清PDGF顯著高于模型組而Profilin-1水平顯著低于模型組（P＜0.05）（表3）。

2.4 組間PI3K/Akt/Sirt1信號通路表達(dá)水平比較模型組大鼠心肌組織PI3K、Akt、Sirt1蛋白和mRNA水平顯著低于對照組（P＜0.05），左卡尼汀組大鼠心肌組織PI3K、Akt、Sirt1蛋白和mRNA水平顯著高于模型組（P＜0.05）（表4）。

表1 組間cTnT 和CK-MB水平比較

表2 三組細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡比較

表3 三組PDGF、Profilin-1水平比較

表4 三組大鼠PI3K、Akt、Sirt1蛋白和mRNA水平比較

3 討論

AMI是由于冠狀動脈急性引起的心肌梗死，具有發(fā)病急、進(jìn)展快等特點(diǎn)，具有極高的病死率，且預(yù)后差異大，對患者生活和生命造成極大威脅[6]。近年來研究顯示左卡尼汀具有保護(hù)壞死心肌，減少缺血-再灌注對心肌的損傷的作用。PI3K/Akt是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡的主要途徑，PI3K/Akt也具有調(diào)節(jié)AMI患者心肌細(xì)胞凋亡的作用[7]。

肌肉細(xì)胞是消耗能量較大的細(xì)胞，左卡尼汀可促進(jìn)三羧酸循環(huán)正常進(jìn)行從而生成細(xì)胞代謝或活動所需的能量，并通過調(diào)節(jié)相關(guān)酶的活性、節(jié)約代謝底物等方式降低耗氧量提高能量產(chǎn)生率，這會幫助降低活性氧自由基的水平，降低氧化應(yīng)激水平和炎性水平，從而保護(hù)心肌細(xì)胞[8-11]。本次研究結(jié)果顯示模型組大鼠血清cTnT和CK-MB水平顯著高于對照組，左卡尼汀組大鼠血清cTnT和CK-MB水平顯著低于模型組。模型組大鼠心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著低于對照組而凋亡率顯著高于對照組，左卡尼汀組大鼠心肌細(xì)胞活力顯著高于模型組而凋亡率顯著低于模型組。過往研究也顯示左卡尼汀可以保護(hù)心肌細(xì)胞，降低心肌酶譜cTnT和CK-MB的水平[12]。

Sirt1是PI3K/Akt的下游的蛋白，可往返于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，有研究發(fā)現(xiàn)硫化氫保護(hù)心肌細(xì)胞缺血-再灌注損傷的同時可以提高Sirt1的水平，PI3K/Akt/Sirt1信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡中起著重要作用[13]。PDGF有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞分裂的作用，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。本次研究結(jié)果顯示模型組大鼠血清PDGF顯著低于對照組而Profilin-1水平顯著高于對照組，左卡尼汀組大鼠血清PDGF顯著高于模型組而Profilin-1水平顯著低于模型組。模型組大鼠心肌組織PI3K、Akt、Sirt1蛋白和mRNA水平顯著低于對照組，左卡尼汀組大鼠心肌組織PI3K、Akt、Sirt1蛋白和mRNA水平顯著高于模型組。過往研究顯示PDGF可通過促進(jìn)PI3K/Akt通路的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞凋亡[15]。李曉娜等[16]研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)PDGF可能通過下調(diào)PI3K/Akt通路減少膠原分泌、抑制表型轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮抗心肌纖維化作用。此外，PDGF還具有促進(jìn)心血管生成的作用，從而改善心肌血流循環(huán)，改善缺氧狀況[17]。研究顯示高氧化應(yīng)激水平會引起Profilin-1水平的升高，最新的研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死大鼠中Profilin-1的水平升高，并于促凋亡蛋白Bax的水平呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系[18]。提示左卡尼汀可上調(diào)PDGF的水平，一方面上調(diào)PI3K/Akt/Sirt1通路的表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖并抑制器凋亡，另一方面，可促進(jìn)血管生成改善氧化應(yīng)激水平，使Profilin-1的水平下調(diào)[19,20]。

綜上所述，左卡尼汀具有促進(jìn)PDGF和PI3K/Akt/Sirt1表達(dá)的作用，促進(jìn)心肌增殖并抑制細(xì)胞凋亡，同時可改善氧化應(yīng)激狀態(tài)使Profilin-1的水平下調(diào)，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。