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    基于聚多巴胺納米粒子的熒光增強型探針檢測乙酰膽堿酶

    2019-12-05 05:41:10杜方凱李夢汝莫遠健譚學(xué)才黃乃陽黃安娜
    分析測試學(xué)報 2019年11期
    關(guān)鍵詞:多巴胺探針粒子

    杜方凱,李夢汝,莫遠健,譚學(xué)才,黃乃陽,黃安娜

    (廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,廣西高校食品安全與藥物分析化學(xué)重點實驗室,廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室,廣西 南寧 530006)

    乙酰膽堿酶(Acetylcholinesterase,AChE)是存在于生物體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種絲氨酸蛋白酶,能催化神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水解,具有終止神經(jīng)傳導(dǎo)的作用[1-2],且與阿爾茨海默病密切相關(guān)[3-4]。因此,建立一種準(zhǔn)確、靈敏、簡便、特異性檢測AChE的方法在阿爾茨海默病的診斷和治療方面具有重要意義。

    近年來,用于AChE檢測的方法主要有比色法[5-7]、化學(xué)發(fā)光法[8]、電化學(xué)法[9-11]和熒光法[12-14]。其中,熒光法因具有靈敏度高、響應(yīng)時間快、實時檢測酶活性的優(yōu)點,引起廣泛關(guān)注[15-24]。迄今為止,研究者基于有機染料[25]、量子點[26]、重金屬納米簇[27-28]等熒光材料已構(gòu)建了一些檢測AChE的熒光探針。但上述熒光材料均存在有機染料水溶性和光穩(wěn)定性差、量子點的毒性、貴金屬納米簇穩(wěn)定性低和成本高等缺點。因此,發(fā)展價格低、水溶性和光穩(wěn)定性好可用于AChE熒光檢測的材料仍然存在挑戰(zhàn)。

    圖1 基于F-PDA對乙酰膽堿酶的檢測示意圖Fig.1 Schematic illustration of the F-PDA for AChE detection

    聚多巴胺熒光納米粒子(F-PDA)是在氧化應(yīng)激或堿性(pH>7.5)條件下,多巴胺通過共價鍵、氫鍵、π-π等相互作用聚合而成的一種新型納米材料[29]。F-PDA不僅具有顯著的光學(xué)、電學(xué)和磁學(xué)特性,還具有良好的生物相容性和生物降解性,廣泛應(yīng)用于能源、水處理、分析檢測等各個材料科學(xué)領(lǐng)域[30-31]。目前,基于聚多巴胺熒光納米粒子的熒光響應(yīng)分析已應(yīng)用于堿性磷酸酶定量測定[32]。

    本研究以多巴胺鹽酸鹽為原料,采用一步法合成了F-PDA,與MnO2納米片復(fù)合時,其熒光猝滅;而當(dāng)體系中存在AChE時加入硫代乙酰膽堿(ATCh),AChE可以催化ATCh水解生成硫代膽堿(Thiocholine,TCh),而將MnO2還原為Mn2+并引發(fā)MnO2納米片的分解,導(dǎo)致F-PDA的熒光恢復(fù),基于此,實現(xiàn)了對AChE的熒光檢測(響應(yīng)機理見圖1),方法操作簡單、靈敏度高、成本低。

    1 實驗部分

    1.1 試劑與儀器

    多巴胺鹽酸鹽、氫氧化鈉(NaOH)、37%鹽酸(HCl)、磷酸二氫鈉·二水(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氫二鈉·十二水(Na2HPO4·12H2O)、四水合氯化錳(MnCl2·4H2O)、四甲基氫氧化銨(TMA·OH)、雙氧水(H2O2)、乙酰硫代膽堿碘化物(ATCh)購自阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;乙酰膽堿酯酶、牛血清蛋白、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、青霉素酶、溶菌酶均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司,其他試劑為市售分析純,實驗用水為超純水。

    F4600型熒光分光光度計、H-7650型透射電鏡(日本日立公司),紫外可見分光光度計(美國瓦里安公司)。

    1.2 實驗過程

    1.2.1 F-PDA納米粒子的合成根據(jù)文獻方法[33]修改后合成F-PDA粒子:首先用超純水配制濃度為20 mmol/L多巴胺鹽酸鹽溶液,再精密量取400 μL多巴胺鹽酸鹽溶液與320 μL 100 mmol/L氫氧化鈉溶液加入7.08 mL 2 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)中,隨后在磁力攪拌器上于室溫下攪拌1 h,最后加入200 μL 0.2 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)體系至酸性,降低反應(yīng)的聚合速率,終止反應(yīng),得亮褐色聚多巴胺熒光納米粒子(F-PDA)溶液。

    1.2.2 MnO2納米片的制備根據(jù)文獻方法[34]制備MnO2納米片:稱取2.174 8 g四甲基氫氧化銨(TMA·OH)溶于18 mL超純水中,再加入2 mL 30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))H2O2中得到0.6 mol/L含3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))H2O2的TMA·OH溶液。將10 mL 0.3 mol/L MnCl2溶液加入100 mL三口圓底燒瓶中,再將20 mL TMA·OH溶液(0.6 mol/L,含3% H2O2)迅速倒入三口圓底燒瓶中(該步驟需在15 s內(nèi)完成),可觀察到2種無色溶液混合后迅速變成深棕色懸浮液,于室溫下攪拌24 h,待反應(yīng)結(jié)束后,以10 000 r/min離心10 min,再用乙醇洗滌7次(每次15 mL),冷凍干燥后得固體MnO2納米片。

    1.2.3 AChE活性檢測取750 μL二氧化錳納米片溶液(512 μg/mL)和200 μL F-PDA納米粒子添加至1 830 μL的PBS(pH 7.4,10 mmol/L)溶液中,并于37 ℃下孵育2 min。然后分別將120 μL ATCh溶液(50 mmol/L)和100 μL不同濃度(終濃度為0、5、10、25、100、250、500 mU/mL)的AChE與上述F-PDA-MnO2納米復(fù)合溶液混合,在37 ℃下反應(yīng)40 min,最后進行熒光測量。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 F-PDA與MnO2納米片的表征

    本氧化法制備的F-PDA分散性較好,由電子透射電鏡圖可見其平均粒徑約18 nm(圖2A)。F-PDA的紫外-可見吸收光譜圖在約287 nm處有一個特征吸收峰(圖2B),其熒光激發(fā)和發(fā)射光譜在415 nm處有一個強熒光激發(fā)峰,在458 nm處發(fā)出強的熒光發(fā)射峰(圖2C),其熒光強度在激發(fā)波長為360~440 nm范圍內(nèi)呈先增大后降低的趨勢(圖2D),最大發(fā)射波長依然為458 nm,表明F-PDA熒光納米粒子不具有激發(fā)波長依賴性。由此可見,F(xiàn)-PDA熒光納米粒子已成功制備。

    MnO2納米片是以MnCl2為原料,在TMA和H2O2下發(fā)生氧化反應(yīng)獲得,對其進行紫外-可見光譜表征,發(fā)現(xiàn)吸收光譜在300~600 nm范圍出現(xiàn)寬的吸收峰,且在約400 nm處出現(xiàn)峰值,與F-PDA的發(fā)射峰有很好的重疊,是F-PDA理想的能量受體,為構(gòu)建FRET體系提供了基礎(chǔ)。為進一步確認(rèn)MnO2納米片的性質(zhì),對其進行了拉曼光譜測試(圖3B),發(fā)現(xiàn)在565.3、653.8 cm-1處有2個明顯的峰,歸因于Mn—O的拉伸振動,表明MnO2納米片已成功制備。

    設(shè)計了以F-PDA為熒光信號團、MnO2納米片為猝滅劑的生物復(fù)合探針用于AChE檢測(圖4)。結(jié)果顯示,在415 nm激發(fā)波長下,F(xiàn)-PDA在458 nm處有一強發(fā)射峰(曲線a),當(dāng)加入MnO2納米片后,其熒光強度顯著降低(曲線b),這是由于F-PDA和MnO2納米片之間發(fā)生了FRET效應(yīng)。而在ATCh和AChE的作用下,猝滅的熒光被恢復(fù)(曲線c),這是因為AChE能夠催化ATCh水解產(chǎn)生了能誘導(dǎo)MnO2納米片分解的硫代膽堿(TCh),使體系熒光恢復(fù)[14]。由此可見,F(xiàn)-PDA@MnO2和F-PDA@MnO2-ATCh-AChE能使F-PDA熒光產(chǎn)生顯著的猝滅和恢復(fù),表明構(gòu)建的F-PDA@MnO2熒光探針可用于AChE檢測。

    圖4 F-PDA(a)、F-PDA@MnO2(b)和F-PDA@MnO2-ATCh-AChE(c)的熒光發(fā)射光譜圖Fig.4 Fluorescence emission spectra of the F-PDA(a),F-PDA@MnO2(b) and F-PDA@MnO2-ATCh-AChE(c)

    2.2 實驗條件的優(yōu)化

    2.2.1 pH值對F-PDA熒光的影響實驗考察了不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)對F-PDA熒光強度的影響,結(jié)果顯示,F(xiàn)-PDA的熒光強度隨pH值增大而增強,且在pH=7.0時達最大值,并在堿性條件下趨于穩(wěn)定。綜合考慮熒光強度和生理環(huán)境,選擇pH 7.4為后續(xù)測試條件。

    2.2.2 MnO2濃度對F-PDA熒光猝滅的影響探針中MnO2納米片的濃度對F-PDA納米顆粒的熒光強度有顯著影響。在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的基礎(chǔ)上,F(xiàn)-PDA納米顆粒在458 nm處的熒光強度隨MnO2納米片濃度的增加逐漸降低(圖5A),猝滅效率隨之增加(圖5B)。當(dāng)MnO2納米片質(zhì)量濃度增至128 μg/mL時,猝滅效率上升緩慢,基本達到平衡。當(dāng)MnO2納米片質(zhì)量濃度增至192 μg/mL,猝火效率可達84%。由于較低濃度的MnO2納米片無法較高程度地猝滅F-PDA的熒光,而高濃度MnO2納米片雖可完全猝滅F-PDA的熒光,但游離的MnO2納米片優(yōu)先與TCh反應(yīng)導(dǎo)致敏感度偏低。因此,選擇128 μg/mL MnO2納米片為實驗最佳濃度。

    圖6 不同體系下的紫外光譜圖Fig.6 UV-Vis absorption spectra of different systems

    圖7 不同濃度乙酰膽堿酶對F-PDA@MnO2體系的熒光恢復(fù)光譜Fig.7 Fluorescence recovery spectra of different concentrations of AChE for F-PDA@MnO2 systemCAChE:0,5,10,25,50,100,250,500 mU/mL

    2.2.3 底物ATCh濃度對F-PDA@MnO2熒光探針的影響

    AChE可催化ATCh水解生成具有還原性的TCh,兩者具有相關(guān)性,且化學(xué)計量比為1∶1。因此,實驗根據(jù)文獻方法合成了TCh[35],研究底物ATCh濃度對探針的影響。結(jié)果顯示,在添加1 mmol/L TCh后,可明顯觀察到F-PDA熒光的恢復(fù),繼續(xù)增大TCh濃度至2 mmol/L,F(xiàn)-PDA的熒光恢復(fù)達到最大值。因此,實驗選擇底物ATCh濃度為2 mmol/L。為了驗證F-PDA熒光恢復(fù)機理,對不同體系的紫外-可見吸收光譜進行了掃描(圖6)。由圖可見,F(xiàn)-PDA和MnO2納米片分別在287 nm(曲線a)和400 nm(曲線b)處有一特征吸收峰。當(dāng)F-PDA與MnO2復(fù)合后,體系兼具兩者的特征吸收峰(曲線c)。加入TCh后,MnO2的特征吸收峰消失(曲線d),Mn2+的吸收光譜未顯示出任何吸收峰(曲線e),F(xiàn)-PDA@MnO2-TCh體系的吸收光譜非常接近F-PDA或F-PDA-Mn2+的吸收光譜(曲線f),由此證明TCh能將MnO2納米片還原為Mn2+。

    2.3 復(fù)合物探針對AChE的檢測

    在最優(yōu)實驗條件下,采用F-PDA@MnO2復(fù)合物探針對AChE進行檢測(圖7)。結(jié)果顯示,隨著AChE濃度的增加,體系熒光強度逐漸增強,5.0 mU/mL AChE即可觀察到明顯的熒光恢復(fù),100 mU/mL AChE可使F-PDA的熒光恢復(fù)90%以上,且在5.0~100 mU/mL范圍內(nèi),體系熒光強度與AChE濃度呈良好的線性關(guān)系,線性方程為IF=5.554CAChE+326.769(r2=0.996),由此計算得檢出限(LOD,S/N=3)為0.14 mU/mL,表明探針可靈敏檢測AChE。

    在優(yōu)化條件下,向PBS緩沖溶液中加入不同濃度(30、60、90 mU/mL)的AChE標(biāo)準(zhǔn)溶液進行回收率研究。結(jié)果顯示,其加標(biāo)回收率為89.5%~120%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=3)為1.6%~2.5%(表1)。表明該方法可應(yīng)用于緩沖溶液中AChE的檢測。

    2.4 探針的選擇性

    在F-PDA@MnO2檢測體系中分別加入20 μg/mL過氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOx)、青霉素酶(PCN)、溶菌酶(Lys)、牛血清蛋白(BSA)考察探針的選擇性。結(jié)果顯示所加物質(zhì)對體系熒光強度幾乎無影響,不干擾AChE的測定,說明該體系對AChE具有較好的選擇性。

    表1 乙酰膽堿酶的回收率Table 1 Recoveries of acetylcholinesterase

    3 結(jié) 論

    本研究以多巴胺為原料,通過氧化法合成了具有強烈熒光的水溶性聚多巴胺納米粒子,基于MnO2納米片復(fù)合的 F-PDA@MnO2構(gòu)筑了增強型熒光探針用于AChE的高靈敏檢測。結(jié)果顯示,所制備的F-PDA@MnO2熒光探針具有靈敏度高、選擇性好及檢出限低等優(yōu)點,可為拓展F-PDA納米粒子在其他生物分子檢測方面的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

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