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    雙水相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定倒提壺中8種生物堿

    2019-12-05 05:41:10樊輕亞許衛(wèi)軍代春美
    分析測(cè)試學(xué)報(bào) 2019年11期
    關(guān)鍵詞:提壺雙水芥菜

    樊輕亞,許衛(wèi)軍,代春美

    (1.信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院,河南 信陽(yáng) 464000;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院,北京 100700)

    倒提壺(CynoglossumamabileStapfetDrumm)是著名的藥用植物,以根及全草入藥,有清熱利濕、散瘀止血、止咳等功效[1-2]。倒提壺的主要成分是吡咯里西啶類生物堿,在臨床中有著非常重要的藥用價(jià)值[3-5]。姚志道[6]和買(mǎi)買(mǎi)素唐[7]等發(fā)現(xiàn)倒提壺生物堿治療神經(jīng)衰弱具有較好的療效。劉清華等[8]研究發(fā)現(xiàn),毛果天芥菜堿對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤系統(tǒng) Walker-256 系統(tǒng)有顯著活性。陳昭文等[9]研究發(fā)現(xiàn)綠花倒提壺堿(Virdiflorine)具有增強(qiáng)小鼠心肌耐缺氧作用。Pandey 等[10]發(fā)現(xiàn)天芥菜堿能顯著降低尼古丁所致的神經(jīng)節(jié)激動(dòng)效應(yīng),而刺凌德草堿(Echinatine)不僅有神經(jīng)節(jié)阻滯作用,還能增強(qiáng)腎上腺素的升壓作用。因此,研究倒提壺中生物堿具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

    雙水相萃取系統(tǒng)(Aqueous two-phase system,ATPS)是由兩種化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的親水性聚合物,或一種親水性聚合物、低分子量親水性有機(jī)溶劑與無(wú)機(jī)鹽在水中以適當(dāng)濃度而形成的互不相容的兩水相系統(tǒng),利用目標(biāo)物在兩相中的不同分配特性從而實(shí)現(xiàn)分離[11-12]。雙水相體系最早發(fā)現(xiàn)于1896 年,經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展,雙水相萃取技術(shù)已應(yīng)用于生物、食品、醫(yī)藥以及稀有金屬的分析[13-15]。近年來(lái)雙水相體系發(fā)展迅速,在中藥有效成分的萃取分離中逐漸得到應(yīng)用,顯示了良好的應(yīng)用前景[16-19]。由于其具有操作環(huán)境溫和,不改變目標(biāo)物質(zhì)的生物活性,避免了使用有機(jī)溶劑,且操作條件簡(jiǎn)單,節(jié)約成本,符合綠色化學(xué)的發(fā)展要求,因此是一種具有極大發(fā)展前景的萃取技術(shù)。

    超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)具有較高的靈敏度、選擇性和重現(xiàn)性,可確保復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確定量[20-22]。本文首次將雙水相萃取技術(shù)引入中藥材倒提壺中有效成分的分離,采用 UHPLC-MS/MS技術(shù)建立了倒提壺中8種生物堿(天芥菜品、毛果天芥菜堿、綠花倒提壺堿、天芥菜堿、天芥菜定、刺棱德草堿、仰臥天芥菜堿、歐天芥菜堿)含量測(cè)定的方法,從而為更加全面地控制倒提壺藥材的質(zhì)量,開(kāi)發(fā)倒提壺制劑提供了可靠依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器、試劑與材料

    DFY-200搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司);美國(guó) Waters Xevo TQ-MS型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源;天芥菜品、毛果天芥菜堿、綠花倒提壺堿、天芥菜堿、天芥菜定、刺棱德草堿、仰臥天芥菜堿、歐天芥菜堿對(duì)照品(純度為98.5%,武漢ChemFaces有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,美國(guó)默克公司)。實(shí)驗(yàn)用倒提壺藥材均購(gòu)于網(wǎng)絡(luò)藥材市場(chǎng),經(jīng)鑒定為倒提壺(CynoglossumamabileStapfetDrumm)全草。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 乙醇回流法提取生物堿稱取一定量粉碎過(guò)100目篩的倒提壺藥材,加4倍量95%乙醇回流3次,每次1.5 h,過(guò)濾,濾液合并,濃縮,備用。

    1.2.2 雙水相體系的配制稱取一定量的K2HPO4·3H2O,加入一定量的水,超聲溶解,加入30%乙醇,振搖,靜置,使形成乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系。

    1.2.3 雙水相法萃取提取液(ATPE)取經(jīng)“1.2.1”提取后的倒提壺生物堿粗提液浸膏,用鹽酸或氨水分別調(diào)節(jié)水相 pH 值。加入EtOH/K2HPO4·3H2O雙水相溶液,25 ℃下超聲萃取20 min,取上清液,轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層后,取上層有機(jī)相待測(cè)。

    1.2.4 溶劑法萃取提取液(SE)取經(jīng)“1.2.1”提取后的倒提壺生物堿粗提液浸膏,用稀鹽酸溶液超聲溶解后置于分液漏斗中,氯仿萃取后,旋干,用甲醇定容后,待測(cè)。

    1.2.5 反膠束法萃取提取液(RME)[23]取經(jīng)“1.2.1”提取后的倒提壺生物堿粗提液浸膏,以 KCl調(diào)節(jié)水相的離子強(qiáng)度,加入4倍體積的二(2-乙基己基)磷酸酯/二(2-乙基己基)丁二酸酯磺酸鈉(DOLPA/AOT)-異辛烷反膠束溶液,電磁攪拌萃取后取上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至一錐形瓶中,加入等體積的水,室溫下進(jìn)行電磁攪拌反萃取 30 min后,轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層,取下層水相待測(cè)。

    1.2.6 對(duì)照品溶液的制備精密稱取8種對(duì)照品各10.0 mg,分別用甲醇溶解并定容至10 mL,得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取儲(chǔ)備液各1 mL,置于50 mL容量瓶中,用甲醇定容后即得混合對(duì)照品溶液。

    1.3 樣品分析條件

    1.3.1 色譜條件色譜柱:ACQUITY UPLC BHE C18(50 mm×2.1 mm,1.7μm,美國(guó)Waters公司);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1 mol/L醋酸銨(B),梯度洗脫程序:0~2 min,5%~15%A;2~7 min,15%~40%A;7~10 min,40%~80%A;10~12 min,80%~5%A;柱溫:30 ℃;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:3 μL。

    1.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源:ESI;檢出模式:正離子模式;離子源溫度:100 ℃;質(zhì)量掃描范圍:10~600m/z;干燥氣(N2)流速:10.0 L/min;干燥氣溫度:350 ℃;毛細(xì)管電壓:3.5 kV;錐孔氣流量:50 L/h;碰撞氣流量:2.5 L/h。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 雙水相體系的篩選及萃取條件的優(yōu)化

    影響雙水相萃取的因素較多,為了篩選合適的雙水相體系,本文采用單因素實(shí)驗(yàn)方法考察乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)、萃取劑與樣品的相比、水相體系的pH值等萃取條件,研究了各萃取條件對(duì)倒提壺中8種生物堿萃取率的影響。

    2.1.1 雙水相體系成相物質(zhì)的篩選將無(wú)水乙醇與不同的無(wú)機(jī)鹽按一定比例混合,按是否成相及成相的難易程度,成相范圍的寬窄等為指標(biāo),初步篩選雙水相的成相物。實(shí)驗(yàn)考察了不同無(wú)機(jī)鹽(NH4)2SO4、K2HPO4·3H2O、Na2CO3、CaCl2、Na2SO4、NaCl與乙醇形成雙水相的性質(zhì),結(jié)果顯示,K2HPO4·3H2O、(NH4)2SO4能與無(wú)水乙醇形成穩(wěn)定的雙水相體系,而Na2CO3、Na2SO4雖然也能與無(wú)水乙醇形成雙水相,但成相范圍很窄,下相容易產(chǎn)生沉淀,其他無(wú)機(jī)鹽則不能與無(wú)水乙醇形成雙水相體系。

    進(jìn)一步采用濁點(diǎn)滴定法繪制EtOH/(NH4)2SO4與EtOH/K2HPO4·3H2O兩種雙水相體系的相圖。由實(shí)驗(yàn)可知,在醇的質(zhì)量濃度較小時(shí),分相所需的無(wú)機(jī)鹽的量較大,乙醇/K2HPO4雙水相體系比EtOH/(NH4)2SO4體系的分相曲線更接近原點(diǎn),在鹽質(zhì)量濃度相同的情況下僅需較少的醇即可形成雙水相體系,說(shuō)明EtOH/K2HPO4·3H2O比EtOH/(NH4)2SO4更易形成雙水相,故本實(shí)驗(yàn)選擇EtOH/K2HPO4·3H2O雙水相體系進(jìn)行后續(xù)研究。

    2.1.2 EtOH和K2HPO4·3H2O的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)8種生物堿萃取率的影響EtOH/K2HPO4·3H2O雙水相體系的成相原理為乙醇與鹽之間對(duì)水分子的締合競(jìng)爭(zhēng),因此醇與鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)體系的構(gòu)成與性質(zhì),以及目標(biāo)物的萃取都具有極大的影響。兩相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化會(huì)改變體系的成相行為,進(jìn)而影響生物堿在兩相中的分配。在實(shí)驗(yàn)條件下,調(diào)節(jié)萃取劑與樣品相比為6∶1,萃取劑pH值為4.0,對(duì)無(wú)水乙醇和K2HPO4·3H2O的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行考察,結(jié)果見(jiàn)圖1。

    由圖1A可知,固定K2HPO4·3H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%,8種生物堿的萃取率隨乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈先增大后降低趨勢(shì),且當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí),8種生物堿的提取率最大。這是因?yàn)橐掖急壤龃髸r(shí),分相范圍增大,有利于倒提壺生物堿的分配及萃取。但當(dāng)乙醇比例大于30%時(shí),下相有晶體析出,體系不穩(wěn)定,所以萃取率下降,因而選30%乙醇作為最佳比例。

    由圖1B可知,固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%,倒提壺生物堿的萃取率隨著K2HPO4·3H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈先增大后減小趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著K2HPO4·3H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大,分相能力也增大,倒提壺中的生物堿更易增溶到上相中,故萃取率升高,當(dāng)K2HPO4·3H2O的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)20%時(shí),分子間相應(yīng)碰撞增加,分相時(shí)間延長(zhǎng),上相體積減小,溶液中分子間的作用力增大,使得生物堿分子不易進(jìn)入上相。此外,K2HPO4·3H2O的加入量較多時(shí),鹽較難完全溶解,不利于物質(zhì)在相間的擴(kuò)散,故萃取率先增大后減小。最終確定K2HPO4·3H2O的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 20%。

    圖2 雙水相萃取劑與樣品的相比對(duì)倒提壺中8種生物堿萃取率的影響Fig.2 Effect of aqueous two-phase and sample ratios on extraction efficiencies of 8 alkaloids from Cynoglossum amabile Stapf et Drumm1.heliotrine;2.lasiocarpine;3.heliotridine;4.supinine;5.echinatine ;6.heliosupine;7.virdiflorine;8.europine

    圖3 萃取劑pH值對(duì)倒提壺中8種生物堿萃取率的影響Fig.3 Effect of pH value on extraction efficiencies of 8 alkaloids from Cynoglossum amabile Stapf et Drumm1.heliotrine;2.lasiocarpine;3.heliotridine;4.supinine;5.echinatine ;6.heliosupine;7.virdiflorine;8.europine

    2.1.3 萃取劑與樣品相比對(duì)8種生物堿萃取率的影響萃取劑與樣品的相比會(huì)影響固相和液相之間的傳質(zhì)推動(dòng)力。取“1.2.1”提取后的生物堿儲(chǔ)備液,分別加入Et(OH)(30%)/K2HPO4·3H2O(20%)雙水相萃取劑,調(diào)節(jié)萃取劑pH值為4.0,按萃取劑與樣品的相比分別為1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1時(shí)考察萃取物體積與雙水相萃取劑用量的相比對(duì)萃取率的影響(見(jiàn)圖2)。結(jié)果顯示,隨著萃取劑用量的增大,倒提壺生物堿的萃取率逐漸增大,當(dāng)萃取劑和樣品相比為6∶1時(shí),萃取劑基本可將倒提壺中的生物堿萃取完全,繼續(xù)增加萃取劑,萃取效率變化不大。這是因?yàn)橐毫媳仍叫?,兩相間的濃度差越小,從而傳質(zhì)推動(dòng)力就越小,所以萃取率較低。隨著液料比的提高,傳質(zhì)推動(dòng)力得到提高,但成本也相應(yīng)增加,萃取劑與樣品相比大于6∶1時(shí),萃取率已無(wú)明顯變化,綜合考慮,最終選擇萃取劑與樣品的最佳配比為6∶1。

    2.1.4 不同pH值對(duì)8種生物堿萃取率的影響pH值的改變會(huì)影響磷酸鹽的解離,從而影響EtOH/K2HPO4·3H2O體系的相間電位和物質(zhì)的分配系數(shù),同時(shí)物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)也會(huì)隨pH值的變化而變化。取“1.2.1”提取后的生物堿儲(chǔ)備液,分別加入Et(OH)(30%)/K2HPO4·3H2O(20%)雙水相萃取劑,并使萃取劑與樣品的體積比為6∶1,通過(guò)采用氨水調(diào)節(jié)萃取劑的 pH值,考察了不同pH值對(duì)倒提壺中生物堿萃取效果的影響。由圖3可知,生物堿的萃取率隨著水相pH值的升高而增加,在pH 值4.0時(shí),萃取率最大,隨著 pH 的繼續(xù)增大,溶液中帶正電荷的生物堿離子逐漸減少,生物堿主要以游離分子存在(pH 8.0),其與EtOH/K2HPO4·3H2O間的靜電引力逐漸降低,從而導(dǎo)致其萃取率也逐漸降低,當(dāng)pH為12.0時(shí),萃取率幾乎為0,因此實(shí)驗(yàn)選擇最佳pH值為4.0。

    綜上所述,采用EtOH/K2HPO4·3H2O萃取倒提壺中生物堿,最佳萃取條件為30%乙醇/20%K2HPO4·3H2O,萃取劑pH值為4.0,萃取劑與樣品相比為6∶1。

    圖4 藥用倒提壺經(jīng)雙水相萃取后的提取液總離子流圖Fig.4 TIC chromatogram of extract from Cynoglossum amabile Stapf et Drumm by aqueous two-phase extraction1.heliosupine;2.lasiocarpine;3.virdiflorine;4.heliotrine;5.heliotridine;6.echinatine;7.supinine;8.europine

    2.2 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

    2.2.1 色譜條件的優(yōu)化對(duì)倒提壺雙水相萃取后提取液進(jìn)行UHPLC分析,采用乙腈、甲醇與不同濃度氨水、醋酸銨的不同配比作為流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)峰形更加尖銳,在流動(dòng)相中加入一定比例的醋酸銨可以改善峰形和提高離子化效率,且醋酸銨為揮發(fā)性物質(zhì),可減少對(duì)色譜柱的損害。因此,實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-0.1 mol/L醋酸銨溶液為流動(dòng)相,在優(yōu)化的梯度洗脫條件下,8種目標(biāo)化合物可以得到良好分離,且各色譜峰的峰形好、峰對(duì)稱、柱效高,所得總離子流圖如圖4所示。

    2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化分別用質(zhì)譜電噴霧電離源正離子模式和負(fù)離子模式對(duì)8種生物堿進(jìn)行質(zhì)譜分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下幾乎無(wú)質(zhì)譜響應(yīng),因此選擇 ESI(+)作為離子化模式,分別找出這8種化合物的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰,并對(duì)干燥氣體、霧化氣壓力、干燥氣流量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,然后對(duì)母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離,選擇2個(gè)信噪比較高的特征子離子分別作為定量和定性離子對(duì),8種化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。在ESI(+)-MS/MS條件下,8種化合物主要發(fā)生側(cè)鏈酯鍵的斷裂和吡咯里西啶母核與整個(gè)側(cè)鏈的斷裂,8種化合物的質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖5。

    表1 8種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 8 alkaloids

    圖5 8種生物堿的質(zhì)譜裂解途徑Fig.5 Fragmentation pathways of 8 compounds alkaloids1.heliosupine;2.lasiocarpine;3.virdiflorine;4.heliotrine;5.heliotridine;6.echinatine;7.supinine;8.europine

    2.3 線性范圍、檢出限與加標(biāo)回收率

    取8種生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別配制成一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品,按“1.2.3”方法進(jìn)行雙水相萃取,按“1.3”方法進(jìn)行測(cè)定,以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),以質(zhì)量濃度(X,mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程,按信噪比S/N=3,計(jì)算檢出限。精密稱取已測(cè)定含量的倒提壺樣品,分別向其添加低、中、高 3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)水平做6個(gè)平行,計(jì)算其平均回收率。8種生物堿的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及實(shí)際樣品加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表2。由表可知,8種生物堿在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均在0.99以上,檢出限為0.03~0.10 mg/L,8種生物堿的回收率為91.5%~97.6%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于3.0%,方法體現(xiàn)了較高的精密度和準(zhǔn)確度。

    表2 8種生物堿的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、線性范圍、檢出限,及其在實(shí)際樣品中的回收率Table 2 Calibration curves, linear ranges and detection limits of 8 alkaloids, and their recoveries in real sample

    2.4 穩(wěn)定性與重復(fù)性

    精密稱取倒提壺藥材細(xì)粉6份,按實(shí)驗(yàn)方法分別進(jìn)行萃取、處理和測(cè)定,取樣品和對(duì)照品溶液于室溫下放置0~24 h后,進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明穩(wěn)定性和重復(fù)性的RSD均小于2.0%,方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

    2.5 萃取分析及應(yīng)用

    精密稱取3個(gè)產(chǎn)地的倒提壺藥材各100 g,采用雙水相萃取在最優(yōu)條件下萃取藥材中的生物堿,按“1.3”方法測(cè)定其含量,并與“1.2.4”溶劑萃取法及“1.2.5”反膠束萃取法進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果見(jiàn)表3。

    表3 不同產(chǎn)地倒提壺藥材8種生物堿的提取分析結(jié)果(n=3)Table 3 Analytical results of 8 alkaloids from Cynoglossum amabile Stapf et Drumm obtained with different origins(n=3)

    由表3可知,與傳統(tǒng)的溶劑萃取技術(shù)以及反膠束萃取技術(shù)相比,經(jīng)EtOH/K2HPO4·3H2O雙水相萃取后,倒提壺中各種生物堿的萃取效率為傳統(tǒng)溶劑萃取法的2.5倍左右,比反膠束萃取法高20%左右。此外,傳統(tǒng)溶劑萃取法操作復(fù)雜、萃取效率低,且有機(jī)溶劑用量大、殘留多。反膠束萃取法也需使用有機(jī)溶劑,且萃取效率低于雙水相法。由此可見(jiàn),雙水相萃取技術(shù)的操作簡(jiǎn)單、萃取效率高,且避免使用有機(jī)溶劑、成本低,是一種實(shí)用的綠色環(huán)保萃取分離技術(shù)。此外,本文采用UHPLC-MS/MS檢測(cè)方法具有分析時(shí)間短(10 min)、溶劑消耗少等特點(diǎn)。因此,本文所建立的分析方法適用于該中藥材多指標(biāo)成分的定量檢測(cè)。

    從表3還可以看出,在所有產(chǎn)地的倒提壺中以天芥菜堿的含量最高,毛果天芥菜堿次之。此外,不同產(chǎn)地倒提壺中的生物堿含量分布明顯不同,其中云南產(chǎn)倒提壺中生物堿含量明顯高于其他2個(gè)產(chǎn)地。因此,在提取倒提壺中生物堿有效活性成分時(shí),應(yīng)根據(jù)不同產(chǎn)地、氣候及環(huán)境選擇原料,以獲得更高的提取率。

    3 結(jié) 論

    本文將EtOH/K2HPO4·3H2O雙水相萃取技術(shù)應(yīng)用于倒提壺中生物堿的萃取,并優(yōu)化了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定生物堿含量的條件。本萃取方法利用水作為萃取體系,避免使用或盡可能少使用有機(jī)溶劑,可選擇性地將目標(biāo)生物堿與其他雜質(zhì)進(jìn)行分離,萃取效率高,易于工藝放大和連續(xù)操作,且溶劑可以循環(huán)利用,降低了環(huán)境污染,是一種具有極大發(fā)展前景的萃取技術(shù)。進(jìn)一步采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定倒提壺中生物堿的含量,實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同產(chǎn)地倒提壺中生物堿含量的檢測(cè)和評(píng)價(jià)。該方法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確靈敏,可為倒提壺制劑的開(kāi)發(fā)及質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

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