基于位點(diǎn)特異性PCR技術(shù)的豹貓物種鑒定

李 艷，晏 鵬

1 引言

豹貓(Prionailurusbengalensis)是產(chǎn)于亞洲的小型貓科動(dòng)物，分類地位上屬哺乳綱(Mammalia)食肉目(Carnivora)貓科(Felidae)豹貓屬(Prionailurus)。目前，豹貓?jiān)谥袊植加涗浻?個(gè)亞種，包括北方亞種(P.b.euptilura)，分布于東北、華北和西北地區(qū)；華東亞種(P.b.chinensis)，分布于華東、華中和華南地區(qū)；指名亞種(P.b.bengalensis)，分布于云南大部、貴州西部和廣西西部；海南亞種(P.b.hainana)，僅分布于海南島[1]。豹貓作為食物網(wǎng)中的頂級(jí)食肉動(dòng)物，在營養(yǎng)級(jí)序列中占據(jù)著多個(gè)級(jí)別，是維持生態(tài)系統(tǒng)功能和生物多樣性水平的重要物種[2]。豹貓皮張質(zhì)地柔軟，絨細(xì)密，斑點(diǎn)靚麗，是重要的毛皮獸類，其商品皮張又被稱為貍子皮。長(zhǎng)期以來作為毛皮獸而被大量捕殺和貿(mào)易，以及人工經(jīng)濟(jì)林木和農(nóng)作物的大面積墾植而使豹貓棲息地被破壞和惡化是造成近年來我國豹貓資源快速下降的主要原因[1]。目前，豹貓被列為《中國瀕危動(dòng)物紅皮書》易危等級(jí)，也是中國國家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，豹貓及其物種產(chǎn)品被嚴(yán)格禁止國際商業(yè)貿(mào)易[3]。

在實(shí)踐工作中，常見的物種樣品不是動(dòng)物的整個(gè)個(gè)體，多數(shù)是動(dòng)物的糞便、毛發(fā)、殘肢、皮張、骨骼等，這些樣品均非完整且樣品量較小，往往較難從形態(tài)學(xué)上加以識(shí)別，而且不同豹貓個(gè)體間的皮毛色彩及大小差異非常大，更給樣品的物種鑒定工作帶來了困難。各級(jí)執(zhí)法部門在進(jìn)行野生動(dòng)物資源保護(hù)與管理工作時(shí)，精準(zhǔn)的物種鑒定是他們有力執(zhí)法的武器。因此，簡(jiǎn)單、方便、準(zhǔn)確的將目標(biāo)樣品從混淆品中鑒定出來是物種鑒定方法研究的主要方向。

隨著分子生物學(xué)鑒定技術(shù)不斷的發(fā)展，其在野生動(dòng)物物種鑒定中也得到了廣泛的應(yīng)用，極大地彌補(bǔ)了形態(tài)分類學(xué)的不足[4-6]。位點(diǎn)特異性PCR(allete-specific PCR)方法就是近年廣泛應(yīng)用的一種分子鑒定方法，其主要原理是應(yīng)用目標(biāo)物種的位點(diǎn)特異性引物對(duì)未知樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果來判斷是否有目標(biāo)物種，這種方法具有花費(fèi)較少、操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。位點(diǎn)特異性PCR的成功率是建立在位點(diǎn)特異性引物的準(zhǔn)確選擇上。動(dòng)物線粒體DNA上的Cytb基因和12S rRNA基因在物種間序列長(zhǎng)度沒有明顯的差異，尤適合研究種內(nèi)到種間甚至科間的物種鑒別研究[10-11]。這兩種基因是位點(diǎn)特異性引物首選片段。為了使實(shí)驗(yàn)更高效、直觀地將豹貓物種從混淆品中鑒定出來，本實(shí)驗(yàn)把位點(diǎn)特異性PCR與多重PCR技術(shù)一起使用。多重PCR技術(shù)(Multi-PCR)是一種在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的片段的新型PCR方法，具有高效率、低成本的特點(diǎn)，適合多樣品的分析與鑒定[7-8]。

本研究的主要目的是設(shè)計(jì)開發(fā)1對(duì)豹貓物種位點(diǎn)特異性引物，基于本實(shí)驗(yàn)室前期開發(fā)出的1對(duì)中國貓科動(dòng)物通用鑒定引物，利用多重PCR技術(shù)， 經(jīng)過1次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過對(duì)有效擴(kuò)增條帶的判讀實(shí)現(xiàn)對(duì)豹貓物種特異性的鑒定工作。該方法具有準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)，廣泛適用于糞便、毛發(fā)、骨骼等多樣化的樣品，可進(jìn)一步豐富我們對(duì)豹貓物種保護(hù)和研究的手段。

2 材料與方法

2.1 材料及儀器

表1 本實(shí)驗(yàn)所用樣品信息

本實(shí)驗(yàn)所使用的樣品皆保存于安徽師范大學(xué)保護(hù)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室(表1)。本實(shí)驗(yàn)所用試劑包括蛋白酶K(Merck)，PCR反應(yīng)試劑為10×buffer、Mg2+、dNTP(Trans-gene)、Taq聚合酶、引物、滅菌雙蒸水，所用其它試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。PCR反應(yīng)在PTC-200型PCR儀(MJ Research)上進(jìn)行。所有引物均在上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。HL-2000型凝膠成像系統(tǒng)分析、拍照(UVP)。

2.2 引物設(shè)計(jì)

下載GenBank上公布的雪豹、云豹、豹、東北虎、猞猁、豹貓及家貓的線粒體基因組全序列(登陸號(hào)分別為EF551004、EF551002、EF551003、KF990332、JN392459、KF907306及NC001700)，先利用Clustal X 1.83軟件對(duì)這些7種物種全序列進(jìn)行對(duì)位排列分析，再利用Premier Primer 5.0和Oligo 7.0分析，最后設(shè)計(jì)出1對(duì)豹貓物種特異性引物(PB-idF/PB-idR，引物序列專利申請(qǐng)中，暫不公布)。該對(duì)引物可特異性地?cái)U(kuò)增豹貓物種的Cytb基因片段。

本研究中所用7個(gè)貓科動(dòng)物Cytb基因序列經(jīng)Clustal X 1.83軟件對(duì)位排列分析，其總長(zhǎng)均為1140 bp，物種之間的序列差異率分布在10.50% ～ 17.38%之間；其中，豹貓與豹之間的序列差異最大，達(dá)17.38%；7個(gè)貓科物種Cytb基因序列之間差異平均為14.43%(見表2)。線粒體DNA的Cytb基因中既存在較快突變的密碼子位點(diǎn)，又有較慢進(jìn)化的密碼子位點(diǎn)，這種保守序列和突變序列的交叉存在的遺傳特點(diǎn)使其成為在動(dòng)物種上和種下階元系統(tǒng)學(xué)研究及物種鑒定研究中最好的分子遺傳標(biāo)記之一[12,13]。

表2 本研究所用7個(gè)貓科物種Cyt b基因序列的位點(diǎn)差異率(%)

多重PCR中另外一對(duì)引物是中國貓科動(dòng)物的通用鑒定引物組合(Fel-uF/Fel-uR，引物序列在專利申請(qǐng)中)，此對(duì)引物是本實(shí)驗(yàn)室前期的研究成果，可特異性擴(kuò)增國內(nèi)常見貓科動(dòng)物mtDNA內(nèi)長(zhǎng)度約230 bp的12S rRNA基因片段。所有引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

2.3 總DNA的制備

采用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白酶K消化和酚/氯仿抽提總DNA方法[14]。總DNA的過程如下：將0.5g左右樣品放入EP管中，在EP管內(nèi)用消毒小剪刀剪碎。依次加入裂解液500μl，10%SDS 30μl，20mg/ml PK酶3μl，使SDS濃度為0.5%，PK終濃度為100μg/ul，56C水浴消化過夜。加平衡酚500μl，輕微振蕩5分鐘。11000 rpm離心10分鐘，之后取上清液轉(zhuǎn)入新的EP管中。重復(fù)以上兩步。加入二混(氯仿：異戊醇=24：1)500μl，輕微振蕩5分鐘。11000 rpm離心10分鐘，之后取上清液轉(zhuǎn)入新的EP管中。重復(fù)以上兩步。加入冰凍無水乙醇約1000μl，-20C保存1個(gè)小時(shí)左右。12000 rpm離心13分鐘。棄上清液，加入70%乙醇800μl，輕微振蕩半分鐘。13000 rpm冰凍離心13分鐘。再重復(fù)以上兩個(gè)步驟。棄上清液，置于無菌操作臺(tái)上2～3小時(shí)，自然晾干。加入TE 400μl，輕微振蕩，用手指輕彈，放入4C冰箱里約3個(gè)小時(shí)。用電泳檢測(cè)各樣品總DNA，1%瓊脂糖凝膠，電壓95V，結(jié)果均具有清晰明亮條帶。最后，將樣品總DNA放入-20C的冰箱中冷凍保存。

2.4 PCR擴(kuò)增

多重PCR 反應(yīng)總體積設(shè)置為30μl：10×PCR buffer 10μl，Mg2+(25 mmolPL)2μl，引物(豹貓物種特異性引物PB-idF/PB-idR，貓科動(dòng)物的通用鑒定引物Fel-uF/Fel-uR)各1μl，dNTPMix(2 mmolPL)3μl，模板DNA 1μl， Taq酶1.5μl，無菌雙蒸水8.5μl。經(jīng)過多次嘗試調(diào)整，最終多重PCR反應(yīng)程序最優(yōu)設(shè)置為95℃預(yù)變性5 min，32個(gè)循環(huán)(95℃變性40 s、58℃退火30 s、72℃延伸35 s)，72℃終延伸10 min?？侱NA提取和多重PCR擴(kuò)增的操作都包含無菌雙蒸水為模板的陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 位點(diǎn)特異性引物

將本研究中PB樣品的多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及位點(diǎn)特異性引物PB-idF/PB-idR送交上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行目的序列的測(cè)序。利用 MEGA 6軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析，去掉引物序列，獲得了414 bp的序列數(shù)據(jù)(GenBank登錄號(hào)申請(qǐng)中)。經(jīng)過登陸GenBank使用Blast軟件進(jìn)行搜索比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，PB樣品的位點(diǎn)特異性引物擴(kuò)增序列與GenBank中已有的豹貓物種線粒體Cytb基因序列(登錄號(hào)KF907306)的相似性達(dá)到99%。結(jié)果可以確定使用本研究設(shè)計(jì)的位點(diǎn)特異性引物PB-idF/PB-idR組合，可以對(duì)豹貓物種線粒體Cytb基因部分序列有效地?cái)U(kuò)增。

3.2 位點(diǎn)特異性PCR物種鑒定

位點(diǎn)特異性PCR物種鑒定最大的特點(diǎn)是依據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果直接判定目標(biāo)物種的有無。在本研究中位點(diǎn)特異性PCR與多重PCR組合，在PCR反應(yīng)體系中既有本實(shí)驗(yàn)新設(shè)計(jì)的豹貓物種特異性鑒定引物組合PB-idF/PB-idR，又加入了貓科動(dòng)物通用鑒定引物組合Fel-uF/Fel-uR。多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)， 1%瓊脂糖凝膠，EB染色，保持5 V/cm的電壓30min。最后，電泳結(jié)果通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察，攝像保存(圖1)。

M：DL-2000分子標(biāo)記(Takara)；1道：家貓樣品FC；2道：豹貓樣品PB；3道：雪豹樣品PU；4道：猞猁樣品LL；5道：豹樣品PP1；6道：豹樣品PP2；7道：云豹樣品NN；8道：東北虎樣品PT；9道：黃鼬樣品MS；10道：藏酋猴樣品MT；11道：野豬樣品SS；C道：ddH2O空白對(duì)照組

通過電泳圖可知，2號(hào)泳道的豹貓樣品出現(xiàn)了兩條清晰明亮的電泳條帶，分別位于Marker 500 bp的下游附近和250bp的下游附近，即豹貓物種特異性鑒定引物組合PB-idF/PB-idR擴(kuò)增出的414bp目標(biāo)序列和貓科動(dòng)物通用鑒定引物組合Fel-uF/Fel-uR擴(kuò)增出的230bp目標(biāo)序列，而1、3、4、5、6、7、8道貓科其他6中物種樣品均只出現(xiàn)一條清晰明亮條帶，即貓科動(dòng)物通用鑒定引物組合Fel-uF/Fel-uR擴(kuò)增出的230bp目標(biāo)序列，而野豬、藏酋猴和黃鼬樣品均無擴(kuò)增條帶。結(jié)果可知，本研究所設(shè)計(jì)的位點(diǎn)特異性引物組合PB-idF/PB-idR不僅完美的將豹貓與野豬、藏酋猴和黃鼬區(qū)分開，也能很好的將豹貓與貓科其他物種區(qū)分開，因此，位點(diǎn)特異性引物組合PB-idF/PB-idR具有高度的專屬性，能很好把豹貓從其混淆品中鑒定出來，其在豹貓的物種鑒定中具有很大的利用價(jià)值。

4 討論

根據(jù)《中華人民共和國野生動(dòng)物保護(hù)法》的規(guī)定，準(zhǔn)確的物種信息是重要的量刑依據(jù)，直接涉及到犯罪嫌疑人的切身權(quán)力和林業(yè)、公安部門執(zhí)法的嚴(yán)謹(jǐn)程度。因此，在實(shí)際的野生動(dòng)物保護(hù)工作中，對(duì)豹貓物種及其制品進(jìn)行科學(xué)、準(zhǔn)確的物種鑒定是開展各項(xiàng)執(zhí)法工作的前提。先進(jìn)的分子鑒定技術(shù)為野生物種的鑒定、保護(hù)和有效管理提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。目前，常用的分子物種鑒定方法主要有：1)位點(diǎn)特異性PCR，即用目標(biāo)物種位點(diǎn)特異性引物對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)能否產(chǎn)生目的擴(kuò)增產(chǎn)物來鑒定物種；2)RFLP技術(shù)，即應(yīng)用限制性片段多態(tài)性技術(shù)根據(jù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切圖譜特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)物種鑒定[15-16]；3)DNA條形碼技術(shù)，即利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的堿基序列信息對(duì)物種進(jìn)行快速鑒定[17-18]；4)直接測(cè)序法，即用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后所得序列數(shù)據(jù)與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有序列進(jìn)行比對(duì)分析來鑒定物種等[19-20]。相較于其它方法，位點(diǎn)特異性PCR鑒定方法最大的優(yōu)勢(shì)是簡(jiǎn)單、耗時(shí)少。從本研究結(jié)果可以看出，在準(zhǔn)備好鑒定引物組合之后，我們只需要進(jìn)行一次簡(jiǎn)單的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，就可以根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的分離結(jié)果準(zhǔn)確判別待檢物種。其整個(gè)檢測(cè)過程總共耗時(shí)不過4個(gè)小時(shí)，且操作技術(shù)簡(jiǎn)單，在后期將其鑒定引物及試劑開發(fā)成試劑盒產(chǎn)品后，尤其適合基層各級(jí)執(zhí)法單位的快速執(zhí)法。這也將為瀕危野生動(dòng)物的保護(hù)及科研工作提供更為強(qiáng)大的技術(shù)手段，并具有廣泛的應(yīng)用前景。