維藥洋甘菊化學(xué)成分及DPPH自由基清除活性研究

葉 琦，汪 洋，李思嬋，梅 艷

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院，武漢430000

洋甘菊(MatricariachamomillaL.)為菊科(Compositae)母菊屬(Matricaria)一年生草本植物[1]，又名德國洋甘菊或母菊，維吾爾醫(yī)藥又稱巴布那兒、巴木乃[2]，其味微苦、甘香，具有明目、退肝火、祛痰止咳的作用，可有效緩解支氣管炎及氣喘、抑制真菌、消炎解痙[3,4]，為《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊(cè)》所收藏。原產(chǎn)于地中海東部流域和亞洲西北部地區(qū)，古埃及和希臘人常用它作藥物，是一種重要的藥用植物和香料資源，它的干燥頭狀花序已成為一種重要的出口物資。作為一種民族常用藥，洋甘菊在此前的研究中已發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分主要包括揮發(fā)油類、黃酮類、香豆素類、有機(jī)酸類等[5,6]。為更好地開發(fā)利用我國的洋甘菊資源，我們對(duì)新疆產(chǎn)洋甘菊頭狀花序的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從其75%醇提取物中分離得到11個(gè)化合物，通過波譜方法分別鑒定為分別為山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(1)、木犀草素-3′-O-β-D-葡萄糖苷(2)、6-羥基木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(3)、異槲皮苷(4)、5-羥基-4′，7-二甲基-6,8-二甲氧基黃酮(5)、槲皮素-3′-O-β-D-葡萄糖苷(6)、3-羥基苯甲醇(7)、1-(4-羥基苯基)乙烷-1，2-二醇(8)、2-(3-甲氧基-4-羥基苯基)-丙烷 -1，3-二醇(9)、2-(4-羥基乙基)-乙醇(10)、丁香酸(11)。其中化合物1～3，5，7～11為首次從該植物中分離得到，體外活性測試結(jié)果顯示化合物1、2、3、5、6具有較好的清除自由基作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

柱色譜硅膠(200～300目、300～400目)及薄層色譜硅膠G、H(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(瑞典Pharmacia公司)；ODS(40～60 μm)(美國Sepax Technologies)；甲醇、乙腈(均為色譜純)(美國Honeywell公司)；DPPH試劑(美國Sigma公司)；Vitamin E、二甲基亞砜等化學(xué)試劑(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器

AVANCEIII-600型核磁共振儀(德國Bruker公司)；Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；戴安U-3000型半制備液相色譜儀(美國戴安公司)；半制備色譜柱RP18(250 mm×20 mm，5 μm)(日本YMC公司)；EYELAN 1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會(huì))；KQ-100DA型數(shù)超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)； WD-9405B 型水平搖床(沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司)；Melab-U/4C501H 型生物信號(hào)采集系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)。

1.3 藥材

洋甘菊購自于九州通中藥材有限公司，由武漢市第一醫(yī)院余南才主任藥師鑒定為菊科(Compositae)母菊屬(Matricaria)植物洋甘菊(MatricariachamomillaL.)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取分離實(shí)驗(yàn)

將洋甘菊5 kg加10倍體積的75%乙醇回流提取，每次1小時(shí)，將提取液過濾濃縮，得浸膏約1 L，用水分散后，用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮，得到乙酸乙酯浸膏330 g，水層部分濃縮后經(jīng)大孔樹脂D101，水洗至無色后用75%乙醇洗，收集洗脫液回收有機(jī)溶劑，得到浸膏120 g。取部分浸膏(100 g)進(jìn)行硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇-水梯度洗脫(10∶1∶0→70∶30∶5)，收集流份，采用TLC檢測，10%硫酸-乙醇噴霧加熱顯色，合并相同組分，經(jīng)ODS、LH20柱色譜及半制備HPLC等方法進(jìn)行分離純化，得到化合物1(13 mg)、2(15 mg)、3(17 mg)、4(130 mg)、5(21 mg)、6(28 mg)、7(11 mg)、8(36 mg)、9(24 mg)、10(17 mg)、11(19 mg)。

2.2 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

將化合物1～11分別配制濃度為 6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L甲醇溶液，作為實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)配制200 μmol/L的維生素E(Vitamin E)作為對(duì)照組。將不同濃度的樣品溶液100 μL 和DPPH(1 mmol/L)溶液 100 μL于96孔酶標(biāo)板中，加入樣品后振蕩 30 s，在 37 ℃、 517 nm 波長下測定其吸光度值(Ap)；同時(shí)測定不加 DPPH 的樣品空白吸光度值(Ac)和加 DPPH 但不加樣品(以 100 μL甲醇代替樣品)的吸光度值(Amax)[7]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并按公式和回歸方程分別計(jì)算自由基清除率和半數(shù)清除率(IC50)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

DPPH清除率=1-(Ap-Ac)/Amax

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

化合物1黃色結(jié)晶性粉末(MeOH)；可溶于甲醇、乙醇等溶劑；1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：12.68(1H，brs，5-OH)，6.28(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.53(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，8.04(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，5.40(1H，d，J=6.6 Hz，H-1″)；13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：177.4(C-4)，164.1(C-7)，161.1(C-5)，160.0(C-4′)，156.3(C-2)，156.2(C-9)，133.4(C-3)，130.9(C-2′，6′)，120.8(C-1′)，115.1(C-5′)，115.0(C-3′)，104.0(C-10)，100.8(C-1″)，98.7(C-6)，93.6(C-8)，77.4(C-5″)，76.4(C-3″)，74.1(C-2″)，69.8(C-4″)，60.8(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致，故鑒定化合物1為山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物2淡黃色粉末(MeOH)；1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：7.84(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，7.61(1H，dd，J=9.0，2.4 Hz，H-6′)，7.01(1H，d，J=9.0 Hz，H-5′)，6.55(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.4 Hz，H-6)，4.94(1H，d，J=7.6 Hz，H-1″)；13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：181.9(C-4)，164.3(C-2)，163.8(C-7)，161.4(C-5)，157.3(C-9)，150.6(C-4′)，145.7(C-3′)，121.9(C-6′)，121.8(C-1′)，116.4(C-5′)，114.3(C-2′)，103.7(C-10)，103.4(C-3)，101.8(C-1″)，98.9(C-6)，93.9(C-8)，77.4(C-5″)，76.1(C-3″)，73.1(C-2″)，70.1(C-4″)，60.9(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致，故鑒定化合物2為木犀草素-3′-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物3淡黃色粉末(MeOH)；1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：12.88(1H，s，5-OH)，7.81(1H，d，J=7.2 Hz，H-6′)，7.36(1H，s，H-2′)，6.98(1H，s，H-8)，6.88(1H，d，J=6.6 Hz，H-5′)，6.67(1H，s，H-3)，5.03(1H，d，J=5.4 Hz，H-1″)，3.82(2H，d，J=10.2 Hz，H-6″)，3.49～3.30(4H，m，sugar-H)；13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：155.8(C-2)，114.5(C-3)，183.1(C-4)，146.7(C-5)，130.6(C-6)，151.2(C-7)，94.3(C-8)，149.8(C-9)，106.5(C-10)，122.4(C-1′)，113.8(C-2′)，146.3(C-3′)，150.1(C-4′)，116.7(C-5′)，120.0(C-6′)，102.1(C-1″)，73.7(C-2″)，77.2(C-3″)，70.6(C-4″)，76.9(C-5″)，61.7(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，故鑒定化合物3為6-羥基木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物4黃綠色粉末(MeOH)；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.88(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，7.86(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，6.98(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.57(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.32(1H，d，J=2.4 Hz，H-6)，5.34(1H，d，J=7.8 Hz，H-1″)，3.82(1H，dd，J=3.0，2.4 Hz，H-6″α)，3.68(1H，dd，J=6.0，5.4 Hz，H-6″β)，3.59～3.30(4H，m，sugar-H)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：178.8(C-4)，166.5(C-7)，163.1(C-5)，159.7(C-2)，158.6(C-9)，150.2(C-4′)，146.3(C-3′)，136.0(C-3)，123.5(C-6′)，123.4(C-1′)，117.9(C-5′)，116.3(C-2′)，106.1(C-10)，104.7(C-1″)，100.0(C-6)，95.1(C-8)，78.7(C-5″)，78.2(C-3″)，71.6(C-2″)，63.0(C-4″)，60.9(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致，故鑒定化合物4為異槲皮苷。

化合物5黃色針狀結(jié)晶(MeOH)；1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：13.03(1H，s，5-OH)，8.07(2H，s，H-2′，6′)，7.15(2H，s，H-3′，5′)，6.97(1H，s，H-3)，3.86、3.76(3H，each，-OCH3)，2.35、2.10(3H，each，-CH3)；13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：182.8(C-4)，163.8(C-7)，162.5(C-4′)，162.2(C-2)，156.3(C-5)，152.4(C-9)，128.4(C-2′，6′)，123.1(C-1′)，114.8(C-3′，5′)，113.3(C-6)，108.9(C-8)，106.7(C-10)，103.3(C-3)，60.5、55.7(4′，7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致，確定化合物5為5-羥基-4′，7-二甲基-6，8-二甲氧基黃酮。

化合物6黃色針狀結(jié)晶(MeOH)；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.83(1H，s，H-2′)，7.74(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，6.98(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.50(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.28(1H，s，H-6)，3.83(2H，s，H-6′′)，3.60～3.50(4H，m，H-2～5)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：177.7(C-4)，165.9(C-7)，162.9(C-9)，158.4(C-5)，149.1(C-4′)，148.4(C-3′)，146.6(C-2)，124.6(C-3)，124.4(C-1′)，122.1(C-6′)，116.4(C-5′)，116.3(C-2′)，104.9(C-10)，102.9(C-1′′)，99.5(C-6)，94.6(C-8)，75.2(C-3′′)，74.1(C-2′′)，71.2(C-4′′)，78.2(C-5′′)，62.8(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，故鑒定化合物6為槲皮素-3′-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物7無色針狀結(jié)晶(MeOH)；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.29(1H，dd，J=7.8，7.2 Hz，H-5)，7.06(1H，t，J=2.4 Hz，H-2)，6.83(1H，t，J=2.4 Hz，H-6)，6.76(1H，dd，J=7.8，2.4 Hz，H-4)，4.60(2H，s，-CH2)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：156.7(C-3)，142.6(C-1)，130.2(C-5)，118.3(C-6)，115.0(C-4)，114.1(C-2)，65.2(-CH2OH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，故鑒定化合物7為3-羥基苯甲醇。

化合物8白色粉末(CHCl3)；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.21(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.66(2H，d，J=7.8 Hz，H-3′，5′)，4.59(1H，dd，J=6.6，6.0 Hz，H-1)，3.70(2H，m，H-2)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：157.7(C-4′)，133.9(C-1′)，128.2(C-2′，6′)，116.0(C-3′，5′)，74.9(C-1)，68.4(C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，故鑒定化合物8為1-(4-羥基苯基)乙烷-1，2-二醇。

化合物9無色油狀(MeOH)；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：6.98(1H，s，H-2)，6.79(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，6.62(1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，3.89(3H，s，H-10)，3.89～3.69(2H，m，H-8，9)，2.84(1H，m，H-7)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：147.9(C-3)，146.0(C-1，4)，120.2(C-6)，115.2(C-5)，112.0(C-2)，64.9(C-8，9)，56.2(C-10)，49.7(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，故鑒定化合物9為2-(3-甲氧基-4-羥基苯基)-丙烷-1，3-二醇。

化合物10無色針晶(CHCl3)；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.14(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.72(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，3.79(2H，t，J=7.2 Hz，H-8)，2.82(2H，t，J=7.2 Hz，H-7)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：157.0(C-4)，131.2(C-1)，131.1(C-2，6)，116.4(C-3，5)，64.9(C-8)，39.7(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致，故鑒定化合物10為2-(4-羥基乙基)乙醇。

化合物11無色針晶(MeOH)；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.28(2H，s，H-2，6)，3.77(6H，s，3，5-OCH3)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：170.4(C-7)，149.0(C-3 ，5)，141.9(C-4)，122.3(C-1)，108.3(C-2，6)，56.8(3，5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致，故鑒定化合物11為丁香酸。

DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示，化合物1～11均有不同程度的自由基清除能力，且全部具有濃度依賴性。其中化合物1～6為黃酮類化合物，濃度為 200 μmol/L 時(shí)，自由基清除率均大于80%，且化合物1、2、3、5、6的IC50值與陽性對(duì)照維生素E相當(dāng)(表1)，這主要由于結(jié)構(gòu)中富含酚羥基而起到顯著的DPPH清除作用，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。

表1 化合物1～11的DPPH自由基清除率Table 1 DPPH free radical clearance of compounds 1-11

4 討論

本文對(duì)洋甘菊的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的分離和鑒定，從中得到了11個(gè)化合物，主要為黃酮和芳香類物質(zhì)，其中1～3、5、7～11為首次從該植物中分離得到。這為闡明洋甘菊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了一定的依據(jù)。

前期有文獻(xiàn)報(bào)道洋甘菊具有抗炎、抗氧化、降血壓和降血脂的作用，尤其是從中分離得到的黃酮類成分有顯著活性[19，20]。本次研究洋甘菊的主要化學(xué)成分為黃酮和小分子酚酸，而且所發(fā)現(xiàn)的化合物均表現(xiàn)出一定程度的DPPH自由基清除活性，尤其是黃酮類物質(zhì)1～3、5、6表現(xiàn)出與對(duì)照組相當(dāng)?shù)幕钚?，推測洋甘菊可以改善治療多種疾病可能與其含有的抗氧化成分有關(guān)，當(dāng)然，這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。