利用分子標(biāo)記技術(shù)聚合2 個白葉枯病基因改良華占的白葉枯病抗性

倪深 夏春 應(yīng)建成 孫紅偉 陳紅旗

（中國水稻研究所/水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310006；*通訊作者：chqhzfy@126.com）

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是我國65%以上人口的主食[1]。水稻在生長過程中會遭受各種病蟲害的入侵，其中白葉枯病是影響水稻產(chǎn)量的主要病害之一。白葉枯病菌侵害常造成水稻減產(chǎn)20%～40%，嚴(yán)重時甚至顆粒無收[2]。目前大面積推廣的水稻品種多數(shù)不抗白葉枯病，用藥防治效果差、成本高，且嚴(yán)重污染環(huán)境。培育攜帶白葉枯病抗性基因的水稻新品種，是控制水稻白葉枯病發(fā)生和蔓延最為經(jīng)濟(jì)和有效的一種途徑。

20 世紀(jì)80—90年代，我國栽培稻的白葉枯病抗源主要為Xa4 和Xa3，但在栽培稻種植的過程中，有些原先無毒小種發(fā)生了變異，還有些具毒性的劣勢小種上升為優(yōu)勢小種，導(dǎo)致水稻品種逐漸喪失抗性。xa5 和Xa7 等廣譜抗性基因逐漸應(yīng)用于改良常規(guī)稻品種和雜交稻親本的白葉枯病抗性[3]，這2 個抗性基因源自孟加拉國的3 個品種DV85、DV86 和DZ78。xa5 定位于5 號染色體短臂末端SNPS 標(biāo)記RS7 和SSR 標(biāo)記RM611之間，遺傳距離為0.5 cM，物理距離接近70 kb[3]，Xa7是孕穗期專抗的顯性基因，定位于6 號染色體上標(biāo)記GDSSR02 和RM20593 之間，遺傳距離分別為0.07 cM和0.14 cM[4]。

華占是中國水稻研究所通過系統(tǒng)選育的秈型恢復(fù)系，具有恢復(fù)力強(qiáng)、配合力好、綜合性狀好等特點(diǎn)，以其為親本已經(jīng)選育了100 多個組合。但該恢復(fù)系感白葉枯病，為此，本研究利用回交結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)導(dǎo)入xa5 和Xa7 抗性基因，以提高華占對白葉枯病的抗性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

抗性基因供體親本分別為IRBB5（xa5）、鎮(zhèn)R084（Xa7），受體親本為華占。在白葉枯病抗性接種鑒定中，以金剛30 作為感病對照。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多態(tài)性標(biāo)記的篩選

參照BLAIR 等[4-5]對抗病基因的定位結(jié)果，并結(jié)合www.gramene.org 上的分子標(biāo)記整合圖，分別搜索與抗病基因xa5 和Xa7 緊密連鎖的SSR 標(biāo)記，在供體親本和受體親本之間進(jìn)行多態(tài)性檢測，各篩選到1 對緊密連鎖標(biāo)記，分別為RM603 與RM20595。

1.2.2 白葉枯病抗性接種鑒定

接種用菌株分別為PXO99（P6）、CR1、ZHE173、CR6 和OS-225。PXO99 來自菲律賓，其他均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

在復(fù)合雜交分離時代，僅用浙173 菌株接種。改良株系及親本，用上述5 個菌株分別接種鑒定。

采用剪葉接種法接種病原菌，一般在接種后14～21 d 進(jìn)行調(diào)查，每次3～5 張葉片。參考國際水稻研究所標(biāo)準(zhǔn)記載病情[6]。

1.2.3 農(nóng)藝性狀調(diào)查

表1 水稻品種成株期白葉枯病抗性鑒定

圖1 RM603 檢測 華占/ IRBB5//華占///華占的復(fù)交BC1F1

圖2 利用RM20595 檢測華占/鎮(zhèn)084//華占///華占的復(fù)交BC1F1

表2 水稻品種成株期白葉枯病抗性鑒定

華占及其改良株系B3 種植于中國水稻研究所富陽試驗(yàn)基地。每個小區(qū)種植6 行，每行種6 株，栽插規(guī)格為20.0 cm ×23.1 cm 。成熟期各小區(qū)材料隨機(jī)取5株，在室內(nèi)考察農(nóng)藝性狀，主要包括全生育期、株高、單株有效穗數(shù)、平均穗長、每穗總粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等指標(biāo)，重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本的白葉枯病抗性鑒定

水稻分蘗盛期至孕穗初期，在傍晚太陽西斜后，用剪葉法接種4 個水稻品種。成株期的鑒定結(jié)果表明，華占對菌種CR1 表現(xiàn)中抗，對其余4 個菌種表現(xiàn)感病或高感，有必要進(jìn)行抗性改良。IRBB5 和鎮(zhèn)084 對菌株P(guān)XO99 表現(xiàn)為高感，感病對照金剛30 對5 個菌株均表現(xiàn)感?。ū?）。

2.2 華占的改良系的選育及標(biāo)記輔助選擇

以華占為母本，分別與含有Xa7 和xa5 基因的品系鎮(zhèn)084 和IRBB5 進(jìn)行雜交，然后再分別與華占回交2 次，回交過程中用標(biāo)記RM603 與RM20595 輔助選擇（圖1、圖2）。

在BC2F1世代，兩個回交方向分別選擇帶有抗性基因的單株進(jìn)行復(fù)合雜交，在復(fù)合雜交F2世代，用標(biāo)記RM603 與RM20595 進(jìn)行輔助篩選，同時接種白葉枯菌浙173，鑒定白葉枯病抗性。選擇農(nóng)藝性狀與華占相似的，抗浙173 菌株的材料，進(jìn)行3～4 代的自交，最終獲得了3 個穩(wěn)定純合的株系：B1（xa5）、B2（Xa7）和B3（xa5+Xa7）。

2.3 改良株系的白葉枯病抗性評價

在水稻孕穗期用5 個菌種對改良株系進(jìn)行白葉枯病抗性鑒定。結(jié)果表明，感病對照金剛30 對5 個菌系表現(xiàn)為感病或高感，表明接菌反應(yīng)穩(wěn)定，各菌株致病力正常；僅攜帶xa5 或Xa7 基因的改良株系B1 和B2 對菌株P(guān)XO99 均表現(xiàn)為高感，對其他4 個菌株都表現(xiàn)為抗或高抗；攜有xa5+Xa7 基因的株系B3 對PXO99 表現(xiàn)為中感，對其他4 個菌株都表現(xiàn)為高抗，抗性水平明顯好于僅攜帶單基因的B1 和B2（表2）。

2.4 改良株系B3 的主要農(nóng)藝性狀

從表3 可見，改良株系B3 在生育期、穗長、千粒重方面與華占相比差異不顯著；每穗總粒數(shù)和每穗實(shí)粒數(shù)均比華占多，其中每穗總粒數(shù)差異顯著；單株有效穗數(shù)比華占少，差異極顯著?？梢?，改良株系B3 基本保持了華占的優(yōu)良性狀，白葉枯病的抗性卻明顯提高，在今后可以作為良好的育種材料加以應(yīng)用。

3 討論

3.1 本研究改良的雜交稻親本的應(yīng)用前景

由于華占具有配合力好、抗稻瘟病和米質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)，將其改造成抗白葉枯病的新品系，對培育生產(chǎn)上大面積推廣的新組合非常有意義。目前正用大量的不育系進(jìn)行測配，測配組合初步用浙173 菌株進(jìn)行鑒定，表現(xiàn)為高抗。同時，本研究育成的一些抗白葉枯病中間材料，將是選育新的抗病恢復(fù)系的重要供體親本。

3.2 初探聚合基因的選擇

研究表明，抗性基因xa5 和Xa7 對應(yīng)于病原菌中的無毒基因分別為avrxa5（avirulence, avr）和avrXa7。avrxa5 和avrXa7 均屬于avrBs3/pthA 家族基因，前者102bp 的保守序列在基因內(nèi)重復(fù)19.5 次，后者則重復(fù)25.5 次。無毒基因中重復(fù)結(jié)構(gòu)域的交換試驗(yàn)表明，xa5和Xa7 只能分別識別病原菌中的avrxa5 和avrXa7，表現(xiàn)特異的抗病性[7]。

表3 改良株系B3 與華占主要農(nóng)藝性狀比較

xa5 和Xa7 均為廣譜抗性基因，僅當(dāng)病原菌中的avrxa5 和avrXa7 同時發(fā)生變異或兩者重組產(chǎn)生一個新的致病型才能使聚合了xa5 和Xa7 的水稻品種喪失抗性。因此，聚合xa5 和Xa7 的水稻品系具有延緩品種抗性喪失的作用。