豬源生物被膜乳酸菌的篩選、鑒定與體外益生特性評價

靳勝男,舒慧萍,張冬星,康元環(huán),單曉楓,錢愛東

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長春 130118)

隨著我國養(yǎng)豬業(yè)集約化、規(guī)?；目涨鞍l(fā)展,細菌性疾病的頻繁發(fā)生使抗生素得到了廣泛使用,長期使用或濫用抗生素會增強動物機體內(nèi)細菌的耐藥性,并造成畜產(chǎn)品中藥物的殘留,影響?zhàn)B豬業(yè)的生產(chǎn)發(fā)展和人類健康。益生菌通常被定義為活性微生物,具有抑制病原體生長和防止定植、抑制毒力因子表達、增強上皮細胞功能、調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答等益生特性[1-2]。益生菌替代抗生素應(yīng)用于豬生產(chǎn)中,可提高豬的生長性能,降低豬的腹瀉率和死亡率[3-4]。乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是最常見的用于豬的益生菌,包括乳酸桿菌、腸球菌、芽孢桿菌等[5]。乳酸菌產(chǎn)生的過氧化氫、抗菌因子和細菌素,對調(diào)節(jié)宿主腸道中微生物種群和預(yù)防傳染性疾病具有一定的作用[6]。因此,乳酸菌作為益生菌替代抗生素的研究成為當下研究的重點。

大多數(shù)的乳酸菌抗菌試驗研究是在其處于浮游狀態(tài)下進行的。然而,有研究表明,與浮游態(tài)乳酸菌相比,生物被膜態(tài)乳酸菌具有較強的抗菌特性和耐熱、耐酸能力[7]。細菌生物被膜是嵌在胞外聚合物中的附著在菌體表面的微生物群落,生物被膜的形成有利于細菌在惡劣環(huán)境中生存,增強細菌對各種不利因素的抵抗力,使機體具有較強的免疫力[8]。因此,篩選生物被膜型的益生性乳酸菌受到越來越多的關(guān)注。但是,當前豬用乳酸菌部分來源于體外環(huán)境,由于菌株生存的環(huán)境條件發(fā)生變化,環(huán)境之間的差異導(dǎo)致其應(yīng)用效果不佳,無法充分發(fā)揮其益生作用。有學(xué)者認為,理想的動物用乳酸菌最好從同源動物自身消化道中分離篩選[9-10]。鑒于此,通過形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定,從豬新鮮糞便中篩選抑菌效果較好且生物被膜形成能力強的乳酸菌,并對其產(chǎn)酸能力、耐酸堿性、耐胰蛋白酶性、細胞黏附性、生長活性以及安全性等益生特性進行評價,以篩選出具有良好生物學(xué)特性的乳酸菌分離菌株,為豬用益生菌替代抗生素提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus,53103)；指示菌：豬源大腸桿菌(Escherichiacoli,K88、233、236)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium,79102、503、3383、3780、3775)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,519)均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室保存。

1.2 試驗試劑

MRS瓊脂、MRS肉湯培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自北京索萊寶科技有限公司,細菌基因組DNA提取試劑盒購自康為試劑股份有限公司,細胞裂解液購自上海遠慕生物科技有限公司,其他常用試劑均為分析純。

1.3 供試動物和細胞

20只體質(zhì)量約為(18.0±1.0)g的4周齡健康雌性昆明鼠,購自長春市實驗動物中心。豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室保存。

1.4 樣品采集和菌株的分離純化

健康豬新鮮糞便樣品采自吉林長春某養(yǎng)豬場。參照《伯杰細菌鑒定手冊》中的方法進行分離純化,將0.5 g樣品用PBS緩沖液進行倍比稀釋,取100 μL適當梯度的樣品在MRS固體培養(yǎng)基上均勻涂布,37 ℃下厭氧培養(yǎng)48 h。挑取單菌落劃線于MRS平板,獲得純化的菌株,并于甘油中-80 ℃保存。

1.5 革蘭氏染色及觸酶試驗

取少量的純化培養(yǎng)的菌液涂勻至干凈的載玻片上,待干燥、固定后進行革蘭氏染色。在載玻片上,滴加50 μL篩選得到的革蘭氏陽性菌菌液,并加入少量的過氧化氫溶液,獲得無氣泡產(chǎn)生的過氧化氫酶陰性菌。

1.6 抑菌試驗

采用牛津杯法進行抑菌試驗[11]。先取200 μL 107cfu/mL指示菌，分別均勻涂布于固體瓊脂平板表面,在培養(yǎng)基上的牛津杯中放入200 μL過濾的待測菌株上清液,培養(yǎng)12 h,測量抑菌圈直徑。試驗重復(fù)3次。

1.7 生物被膜形成能力測定

將上述抑菌效果較好的分離菌株參考并適當改進STEPANOVIC等[12]的96孔板法進行生物被膜檢測。按照1%比例將待測菌液接入MRS液體培養(yǎng)基, 37 ℃培養(yǎng)36 h,并將菌液濃度調(diào)整至108cfu/mL；將菌液與MRS液體培養(yǎng)基按體積比2∶18以每孔200 μL的量加入96孔細胞培養(yǎng)板中,陰性對照組接入同體積的PBS緩沖液,培養(yǎng)24 h后棄去孔中培養(yǎng)液,用200 μL無菌PBS緩沖液洗滌2次,去除浮游菌,而后加入200 μL 99%的甲醇室溫固定20 min,棄去甲醇,室溫干燥10 min；加入200 μL 0.1%的結(jié)晶紫染液染色10 min,再用同體積無菌PBS洗滌3次,室溫干燥20 min,用33%的乙酸溶液室溫脫色5 min,全自動酶標儀檢測595 nm波長處的吸光值,試驗重復(fù)3次。

1.8 分離菌株分子生物學(xué)鑒定

將篩選出的生物被膜形成能力強的菌株按照細菌DNA提取試劑盒操作說明提取基因組DNA,以基因組DNA為模版,用16S rDNA通用引物(表1)進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,并將PCR產(chǎn)物送至吉林省庫美生物科技有限公司進行測序。獲得的測序序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)序列進行多重比對,采用Mega 7.0 軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[13]。

表1 16S rDNA引物序列

1.9 分離菌株產(chǎn)酸能力測定

將分離菌株按1%比例接入MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h后,取2 mL菌液于EP管中,5 000 r/min離心10 min,吸取上清液,用pH計測量乳酸菌上清液的pH值并記錄,以MRS液體培養(yǎng)基的初始pH值(6.8)作為對照值,試驗重復(fù)3次。

1.10 分離菌株耐酸、堿性能測定

將分離菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,取1 mL菌液6 000 r/min離心10 min,棄上清,用PBS重懸菌體,并將懸液接入10 mL pH值分別為2.0、4.0、6.0、6.8(陰性對照)、8.0、10.0的MRS肉湯培養(yǎng)基中,培養(yǎng)0、1、2、3、4 h,進行菌落平板計數(shù),重復(fù)3次。

1.11 分離菌株耐胰蛋白酶性能測定

將新培養(yǎng)的分離菌株接種至含1%胰蛋白酶的MRS肉湯培養(yǎng)基中,陰性對照組接種同體積的不含胰蛋白酶的MRS肉湯培養(yǎng)基,培養(yǎng)4 h,每間隔1 h進行菌落平板計數(shù),重復(fù)3次。

1.12 乳酸菌生長曲線測定

按1%的接種比例將分離菌株菌液接入100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h,每間隔2 h測定OD600,重復(fù)3次,繪制該分離菌株的生長曲線。

1.13 細胞黏附性測定

參照文獻[14]對分離菌株進行細胞黏附性檢測。取1 mL密度為1×105個/mL的IPEC-J2細胞于細胞6孔板中,放置5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,棄掉培養(yǎng)基,用RPMI-1640細胞培養(yǎng)基輕輕清洗細胞2次,再加入1 mL細胞培養(yǎng)基,同時加入1 mL 1×107cfu/mL分離菌株和鼠李糖乳桿菌(陽性對照),相同條件下培養(yǎng)1 h,再用細胞培養(yǎng)基輕輕洗滌3次,加入1 mL 1%的Triton X-100細胞裂解液于室溫下裂解30 min,10倍倍比稀釋,進行菌落平板計數(shù),計算黏附率：黏附率=(終菌落數(shù)/初始感染細菌數(shù))×100%。

1.14 小鼠致病性試驗

將分離菌株菌液含量調(diào)整為1×107、1×108和1×109cfu/mL，并分別取200 μL梯度菌液濃度,腹腔注射試驗組小鼠(200 μL/只),每組5只小鼠,同時設(shè)置對照組,即腹腔注射等量PBS緩沖液,連續(xù)觀察14 d,記錄小鼠死亡數(shù)量。

1.15 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行分析處理,利用Graph Prism 5.0軟件繪制圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的分離純化及革蘭氏染色

分離純化出2株疑似乳酸菌菌株,在MRS固體培養(yǎng)基上形成表面光滑、圓形、邊緣整齊的乳白色菌落(圖1 A)。革蘭氏染色鏡檢可見，菌體形態(tài)多呈桿狀或短桿狀,無芽孢,無莢膜(圖1B)。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)(A)及革蘭染色結(jié)果(B)

2.2 分離菌株的觸酶試驗

過氧化氫酶試驗結(jié)果顯示,2株疑似乳酸菌菌株中均沒有氣泡產(chǎn)生。表明這2株分離菌株均為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性菌,分別命名為L-3、L-8。

2.3 分離菌株的抑菌試驗

如表2所示,分離菌株L-3、L-8對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的生長抑制效果較好,表明分離菌株L-3、L-8均具有良好的抑菌作用。

注：抑菌圈直徑(包含牛津杯直徑7.80 mm)+：8.00～12.00 mm；++：12.00～16.00 mm；+++：16.00～20.00 mm；++++：20.00～24.00 mm。

Note:Inhibition zone diameter (including Oxford Cup diameter 7.80 mm)+: 8.00—12.00 mm; ++: 12.00—16.00 mm; +++: 16.00—20.00 mm; ++++: 20.00—4.00 mm.

2.4 分離菌株的生物被膜形成能力

如圖2所示,分離菌株L-8的OD595極顯著大于陰性對照組(P<0.01),而分離菌株L-3在595 nm下的吸光值與對照組相比差異不顯著?？梢?與分離菌株L-3相比,L-8的生物被膜形成能力較強。

**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01),下同

2.5 分離菌株L-8的分子生物學(xué)鑒定

如圖 3所示,分離菌株L-8的16S rDNA 經(jīng)PCR擴增后獲得與預(yù)期大小相同的片段(1 500 bp),將獲得的序列進行BLAST比對發(fā)現(xiàn),分離菌株L-8與約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)的同源性達到99.93%。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,分離菌株L-8與約氏乳桿菌處于同一分支(圖4),進一步確定該分離菌株為約氏乳桿菌。

M：DL2000 DNA Marker；1：分離菌株L-8

圖4 分離菌株L-8系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 分離菌株L-8產(chǎn)酸能力

如圖5所示,分離菌株L-8在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后其上清液的pH值為(4.21±0.02),與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。表明分離菌株L-8具有一定的產(chǎn)酸能力。

圖5 分離菌株L-8產(chǎn)酸試驗結(jié)果

2.7 分離菌株L-8酸、堿耐受性分析

如圖6所示,分離菌株L-8在pH 值2.0條件下,隨著培養(yǎng)時間的延長,其活菌數(shù)有所降低,可見分離菌株L-8不能長時間耐受pH 2.0酸性環(huán)境,但在pH值為4.0、6.0、8.0、10.0作用下,隨著培養(yǎng)時間的延長,分離菌株L-8菌液中活菌數(shù)均無下降趨勢,表明分離菌株L-8能夠耐受pH值4.0～10.0的環(huán)境。

圖6 分離菌株L-8酸、堿耐受性試驗結(jié)果

2.8 分離菌株L-8胰蛋白酶耐受性分析

如圖7所示,分離菌株L-8在含1%胰蛋白酶的MRS培養(yǎng)基中作用0～4 h后,其活菌數(shù)與對照組相比無明顯下降趨勢,表明分離菌株L-8菌株對1%胰蛋白酶環(huán)境具有耐受性。

2.9 分離菌株L-8生長曲線

如圖8所示,分離菌株L-8在接種6 h后快速生長進入對數(shù)生長期,直到14 h后其生長速度基本穩(wěn)定。

圖7 分離菌株L-8胰蛋白酶耐受性試驗結(jié)果

圖8 分離菌株 L-8的生長曲線

2.10 分離菌株L-8細胞黏附性分析

如圖9所示,分離菌株L-8對IPEC-J2細胞的黏附率為78.86%,顯著高于陽性對照組(P<0.05),表明分離菌株L-8對豬小腸上皮IPEC-J2細胞具有一定的黏附能力。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)*indicates significant differences compared with the control(P<0.05)

2.11 分離菌株L-8小鼠致病性試驗

小鼠致病性試驗結(jié)果顯示，在3個梯度攻毒的試驗組和PBS 對照組中均未發(fā)現(xiàn)小鼠死亡,表明分離菌株L-8對小鼠沒有致病性。

3 結(jié)論與討論

近年來,微生態(tài)制劑作為抗生素的代替品應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中,取得了顯著的益生作用。乳酸菌作為重要的益生菌,又是動物機體中的優(yōu)勢菌,被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑的生產(chǎn)中。乳酸菌制劑經(jīng)飼喂進入動物體內(nèi),需耐受胃酸、消化酶的作用,具有一定黏附性、良好的生長活性以及對宿主安全無毒性,才能夠定植于動物機體中，從而更好地發(fā)揮益生作用。此外,研究表明,益生菌的候選細菌菌株應(yīng)來源于目標物種,宿主胃腸道微生物菌群中的異種菌株幾乎不可能永久存在[15]。因此,本試驗以健康豬的糞便為樣本,篩選出了L-3和L-8共2株乳酸菌分離菌株。胃腸道感染是造成養(yǎng)豬場重大經(jīng)濟損失的原因之一,乳酸菌的抑菌效果是其發(fā)揮對疾病的預(yù)防和治療作用的關(guān)鍵。L-3、L-8分離菌株的抑菌試驗結(jié)果顯示,這2個菌株可抑制金黃色葡萄球菌、豬源大腸桿菌等的生長,具有較好抑菌效果。劉文華等[16]研究表明,乳酸菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用且抑菌圈直徑分別為 16 mm和14mm,與本試驗結(jié)果類似。史國萃等[17]報道稱,相比于浮游態(tài)的菌株,被膜態(tài)乳酸菌具有較強的抗逆能力。故本試驗進一步對分離菌株L-3和L-8的生物被膜進行了檢測,成功篩選得到具有生物被膜形成能力較強的分離菌株L-8,而后經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為約氏乳桿菌。

乳酸菌是來自豬腸道樣本中最主要的菌屬之一[18]。乳酸菌在生長過程中會分泌有機酸,降低了腸道pH值,有益于在腸道的酸性環(huán)境中存活[19]?？梢?乳酸菌的產(chǎn)酸能力是耐酸和發(fā)揮抑菌作用的重要前提。MISSOTTEN等[20]篩選出的3株乳酸菌的發(fā)酵液pH值在4.2～4.4,與本試驗結(jié)果pH 值4.21～4.23相似,且與初始培養(yǎng)基pH值相比差異顯著。表明本試驗篩選的乳酸菌分離菌株L-8的產(chǎn)酸性能相對良好。酸堿度是影響細菌生長的重要因素,作為益生菌,乳酸菌要對胃內(nèi)的強酸性環(huán)境具有一定耐受性。本試驗中,分離菌株L-8能夠耐受pH 值4.0～10.0的酸堿環(huán)境,并經(jīng)人工胃液pH值2.0處理4 h后,分離菌株的活菌數(shù)雖然降低但依然維持在105cfu/mL；由于動物的消化特性,任何食物均不會在胃中停留較長時間[21],故該分離菌株也可以順利通過胃部到達腸道,在豬腸道中發(fā)揮其益生作用。由于初生仔豬的胰腺和腸腺發(fā)育完全且能夠分泌胰蛋白酶等消化酶,乳酸菌要順利進入動物腸道定植和存活,也需具有對胰蛋白酶的耐受能力。分離菌株L-8在1%胰蛋白酶作用下,細菌存活數(shù)均無變化,表明該分離菌株有抵抗胰蛋白酶的能力,可在腸道中定植生存。

作為益生菌候選菌株,其生長速度也應(yīng)是篩選條件之一。王蔚森等[22]報道,乳酸菌最早可在培養(yǎng)8 h后達到對數(shù)期。本試驗結(jié)果顯示,分離菌株L-8在培養(yǎng)6 h后達到對數(shù)期，并持續(xù)約8 h,表明該菌株生長能力良好。乳酸菌黏附和定植于動物腸道是其發(fā)揮益生作用的首要條件[6],分離菌株L-8對豬小腸上皮細胞的黏附試驗結(jié)果顯示,分離菌株L-8的黏附性能較好。劉蕾等[23]研究發(fā)現(xiàn),形成生物膜的植物乳桿菌L-ZS9的黏附率較浮游態(tài)細菌高1.5倍,該研究結(jié)果與本試驗結(jié)果類似。飼用微生態(tài)制劑的菌種除具備良好的潛在的益生作用外,還需對動物機體安全、無毒性。本試驗對小鼠致病性結(jié)果顯示,約氏乳桿菌L-8對小鼠無致病、致死現(xiàn)象,具有一定安全性,表明分離菌株L-8可作為用于豬生產(chǎn)中的優(yōu)良益生菌。