外源Si、NO對(duì)銅脅迫下小麥幼苗根系生長(zhǎng)及光合作用的影響

張黛靜，楊惠荔，馬建輝，駱婷婷，朱群英，李春喜

(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

銅(Cu)既是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，又是環(huán)境污染的重金屬元素。隨著工業(yè)廢棄物的大量排放和農(nóng)用有害物質(zhì)的不合理輸入，Cu在土壤中的含量大幅增加，已成為土壤中主要的重金屬污染物之一[1]。研究表明，植物體內(nèi)過量的Cu會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)，而根系直接與Cu接觸，最先受到毒害[2]；另外，Cu在植物體內(nèi)富集進(jìn)入食物鏈，對(duì)人類健康也會(huì)構(gòu)成極大威脅[3]。因此，治理和控制土壤Cu污染一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

硅(Si)是植物生長(zhǎng)發(fā)育的非必需元素，但有利于植物的生長(zhǎng)，外源Si不僅可以緩解植物因缺Si表現(xiàn)出的生長(zhǎng)緩慢，還能夠提高植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的耐受能力[4]。LIANG 等[5]研究表明，外源Si可以減輕Cu、Cd(鎘)、Al(鋁)等重金屬對(duì)植物的脅迫。

一氧化氮(NO)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的氣體活性分子，作為分子開關(guān)精確調(diào)控一系列細(xì)胞內(nèi)的生命活動(dòng)[6]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，NO 參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)控非生物脅迫[7-8]。在重金屬脅迫下，添加適宜濃度的外源NO能夠顯著增強(qiáng)植物的抗氧化能力，減輕氧化損傷，有效緩解植物的生長(zhǎng)發(fā)育[9-11]。此外，NO 供體能夠逆轉(zhuǎn)鐵(Fe)低效玉米突變體的黃化性狀[12]，F(xiàn)e和NO還能夠形成亞硝基鐵復(fù)合物降低游離Fe含量，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)Fe的穩(wěn)態(tài)平衡，緩解Fe脅迫[13]。

目前，關(guān)于Si、NO緩解植物Cu脅迫的研究較少[14-15]，對(duì)于兩者緩解效應(yīng)的差異分析還未見報(bào)道。因此，采用水培法，以小麥幼苗為材料，在Cu脅迫下添加外源Si、NO，系統(tǒng)研究Si、NO對(duì)Cu脅迫下小麥幼苗根系形態(tài)、活力、營(yíng)養(yǎng)元素吸收及葉片葉綠素含量、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)的影響，以期為土壤Cu污染的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥(TriticumaestivumL.)品種為矮抗58。挑選籽粒飽滿、大小均勻的種子，用0.1% HgCl2表面消毒6 min，用去離子水反復(fù)沖洗干凈，擺入鋪有濕潤(rùn)濾紙、直徑12 cm的培養(yǎng)皿中，每皿放100粒，預(yù)培養(yǎng)至小麥一葉一心，轉(zhuǎn)至裝有0.5 L Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的無(wú)孔花盆中，置于智能人工氣候箱中進(jìn)行處理。

Cu的供體為CuSO4·5H2O，Si的供體為NaSiO4·9H2O，NO的供體為硝普鈉(SNP)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)室前期基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol/L Cu脅迫程度為中度，1.0 mmol/L Si、0.4 mmol/L NO對(duì)Cu脅迫緩解效果最好[16-17]。本試驗(yàn)采用水培法，設(shè)置4個(gè)處理：CK(對(duì)照，只加營(yíng)養(yǎng)液)、Cu (0.5 mmol/L Cu)、Cu+Si(0.5 mmol/L Cu+1.0 mmol/L Si)、Cu+NO(0.5 mmol/L Cu+0.4 mmol/L SNP)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。智能人工氣候箱培養(yǎng)條件：光照12 h、溫度22 ℃、光強(qiáng)250 μmol/(m2·s)，黑暗12 h、溫度18 ℃，相對(duì)濕度70 %，每2 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液，處理后24、48、96 h取樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 根系形態(tài) 各處理隨機(jī)選取10株小麥幼苗，小心地取出根系，用蒸餾水沖洗干凈，通過根系形態(tài)掃描儀(Epson V700)掃描根系圖像，并結(jié)合WinRHIZO根系分析系統(tǒng)測(cè)定根系長(zhǎng)、表面積、體積、直徑。

1.3.2 根系活力 采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測(cè)定小麥根系活力[18]。用去離子水沖洗干凈小麥根系，取0.5 g根尖裝入50 mL錐形瓶中，加入0.4%TTC溶液和0.067 mol/L磷酸緩沖液各5 mL，充分混合，置于37 ℃黑暗恒溫培養(yǎng)箱中2 h，立即加入1 mol/L H2SO42 mL終止反應(yīng)。隨后，將根尖裝入內(nèi)含10 mL甲醇的管中37 ℃浸提7 h，在分光光度計(jì)485 nm下讀取提取液的吸光度值。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.3 葉綠素含量 葉綠素含量以SPAD值表示，采用葉綠素測(cè)定儀(SPAD-502型)測(cè)定，每個(gè)葉片測(cè)定10個(gè)點(diǎn)取平均值，每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.3.4 Fv/Fm 采用Poket PEA葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定器對(duì)葉片F(xiàn)v、Fm進(jìn)行測(cè)定，夾子夾住葉片，暗反應(yīng)20 min后測(cè)定，每個(gè)處理測(cè)定5次。

1.3.5 營(yíng)養(yǎng)元素含量 取小麥幼苗的根，烘干后用研缽研磨，過0.5 mm篩后量取待測(cè)根樣品0.2 g于消解管中，加入8.5 mL HNO3和1.5 mL H2O2，采用微波消解儀(CEM MARS 6,美國(guó))消解。充分消解后于趕酸器(東方科創(chuàng)EHD-24,北京)上將溶液蒸發(fā)至近干，用去離子水沖洗后定容于25 mL比色管中。采用電感耦合等離子體光譜儀ICP-AES(USA, Perkin Elmer, 2100 DV)測(cè)定Cu、Si、K、Ca、Mg、Na、Fe、Mn、Zn等元素含量。元素標(biāo)準(zhǔn)品由國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心提供，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Si、NO對(duì)Cu脅迫下小麥根系生長(zhǎng)的影響

2.1.1 根系形態(tài) 根系形態(tài)可直觀地反映植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)，是評(píng)價(jià)植物對(duì)重金屬耐性的重要指標(biāo)。由表1可知，與對(duì)照相比，小麥根長(zhǎng)、根表面積、根體積均在Cu處理后降低，且隨處理時(shí)間延長(zhǎng)降幅增大；根直徑隨處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加。處理24 h時(shí)，在Cu脅迫下，添加Si后根長(zhǎng)、根表面積、根體積分別提高了18.7%、27.1%、22.8%，添加NO后根長(zhǎng)、根表面積和根體積分別提高了15.2%、16.0%、17.5%，添加Si處理小麥的根長(zhǎng)、根表面積均大于添加NO處理，說(shuō)明外源Si對(duì)小麥根長(zhǎng)、根表面積、根體積的影響強(qiáng)于NO。處理48、96 h時(shí)，在Cu脅迫下，添加Si和NO均能顯著提高小麥根長(zhǎng)、根表面積、根體積，但提高程度相近，兩者的作用效果沒有顯著差異。Cu脅迫下，施用外源Si、NO提高小麥幼苗根長(zhǎng)、根表面積、根體積的幅度隨著處理時(shí)間的推移而增大。Cu脅迫下，處理24、48 h時(shí)，添加Si、NO增加小麥的根直徑；處理96 h時(shí)，添加Si、NO均顯著降低了小麥的根直徑，降幅分別為6.5%、7.4%，但2種外源物質(zhì)間的差異沒有達(dá)到顯著水平。

表1 外源Si、NO對(duì)Cu脅迫下小麥幼苗根系形態(tài)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示同一時(shí)間不同處理之間差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters after data within a column mean significant differences among different treatments at 0.05 level,the same below.

2.1.2 根系活力 根系活力反映植物根系整體的發(fā)育狀況，是根系生命力綜合評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。由圖1可知，與對(duì)照相比，Cu脅迫顯著降低了小麥的根系活力，處理24、48、96 h時(shí)分別下降了37.7%、46.0%、62.4%，說(shuō)明小麥根系細(xì)胞受損，且脅迫時(shí)間越長(zhǎng)損傷越嚴(yán)重。處理24、48、96 h時(shí)，與Cu處理相比，添加Si處理小麥根系活力分別提高了38.6%、33.4%、97.6%，添加NO處理小麥根系活力分別提高了31.3%、32.9%、120.9%，說(shuō)明施用一定濃度的外源Si和NO可以提高Cu脅迫下小麥的根系活力，可有效緩解小麥根系的損傷。處理24 h時(shí)，添加Si處理小麥根系活力顯著高于添加NO處理，但處理96 h時(shí)相反，說(shuō)明外源Si、NO在不同處理時(shí)間對(duì)根系活力的作用效果不同，處理前期外源Si對(duì)根系活力的影響強(qiáng)于NO，隨著處理時(shí)間的推移外源NO對(duì)根系活力的影響反超Si。

不同小寫字母表示同一時(shí)間不同處理之間差異顯著(P<0.05)，下同

2.1.3 根系營(yíng)養(yǎng)元素含量 Cu脅迫導(dǎo)致植物營(yíng)養(yǎng)元素吸收紊亂，打破植物體內(nèi)離子的平衡。由表2可知，與對(duì)照相比，Cu脅迫24、48、96 h后小麥根系的Cu含量顯著升高。在Cu脅迫下，添加外源Si、NO后，小麥根系Cu含量顯著降低，Si處理下分別降低了45.5%、46.4%、50.9%，緩解效應(yīng)隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)；NO處理分別降低了33.5%、39.5%、39.6%，緩解效應(yīng)隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)先增強(qiáng)后趨于穩(wěn)定。添加Si處理小麥根系Cu含量均顯著低于添加NO處理，表明Si抑制小麥吸收Cu的能力大于NO。Cu脅迫顯著抑制了小麥根系對(duì)Ca、K、Mg、Na、Mn、Zn的吸收，但顯著促進(jìn)了對(duì)Si、Fe的吸收；在Cu脅迫下，添加Si、NO總體上促進(jìn)了根系對(duì)Ca、K、Mg、Na、Fe、Mn、Zn、Si的吸收，并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)變化幅度總體增強(qiáng)。對(duì)于根系中上述元素的積累，外源Si的影響大多強(qiáng)于NO。如：Cu脅迫96 h時(shí)，添加Si處理小麥根系K、Mg、Mn等含量分別提高了11.4%、13.3%、64.9%，添加NO處理分別提高了9.0%、11.7%、41.5%，說(shuō)明Si對(duì)K、Mg、Mn等元素含量的影響大于NO。

表2 外源Si、NO對(duì)Cu脅迫下小麥幼苗根系營(yíng)養(yǎng)元素含量的影響

由表3可知，Cu與Ca、K、Mg、Mn、Zn間表現(xiàn)出拮抗作用，與Fe、Si間表現(xiàn)出協(xié)同作用。其中，Cu含量總體上與K、Mg、Mn、Zn含量均呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。總體上，Mg含量與Mn、Zn含量，Si含量與Na含量均呈極顯著正相關(guān)。

2.2 外源Si、NO對(duì)Cu脅迫下小麥葉片葉綠素含量及Fv/Fm的影響

2.2.1 葉綠素含量 由圖2可知，Cu脅迫處理48、96 h小麥幼苗葉綠素含量顯著低于對(duì)照，小麥幼苗受到一定的脅迫傷害。處理48、96 h時(shí)，添加Si、NO均可顯著提高小麥幼苗葉綠素含量，對(duì)Cu脅迫造成的傷害起到一定的緩解作用，且緩解作用隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。值得注意的是，外源Si對(duì)Cu脅迫下小麥幼苗葉綠素含量的提高作用顯著高于NO，處理96 h時(shí)，添加Si處理小麥葉綠素含量較Cu處理提高了22.2%，添加NO處理提高了13.2%。

表3 外源Si、NO對(duì)Cu脅迫下小麥幼苗根系營(yíng)養(yǎng)元素含量之間的相關(guān)關(guān)系

注：*、**分別表示在 0.05、0.01水平上顯著相關(guān)。

Note：*，** mean significant correlations at 0.05 and 0.01 levels respectively.

圖2 外源Si、NO對(duì)Cu脅迫下小麥幼苗葉綠素含量的影響

2.2.2 Fv/Fm Fv/Fm表示PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率。由圖3可知，與對(duì)照相比，Cu處理小麥幼苗Fv/Fm隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)，但添加Si、NO后Fv/Fm顯著提高，且隨處理時(shí)間延長(zhǎng)提高幅度增加。處理24、48、96 h時(shí)，與Cu處理相比，添加Si處理小麥幼苗Fv/Fm分別提高了2.9%、3.3%、5.4%，添加NO處理分別提高了3.3%、2.4%、3.9%，說(shuō)明外源Si和NO均可以緩解Cu脅迫對(duì)葉綠素?zé)晒獾挠绊?。與NO相比，Si的緩解效果略強(qiáng)于NO，但未達(dá)到顯著水平。

圖3 外源Si、NO對(duì)Cu脅迫下小麥幼苗Fv/Fm的影響

3 結(jié)論與討論

大量研究表明，添加外源Si、NO能夠緩解重金屬對(duì)植物的脅迫傷害，其緩解機(jī)制主要分為2類：一是通過外排和阻止重金屬吸收的避逆作用機(jī)制降低重金屬在植物體內(nèi)的含量；二是通過螯合作用、區(qū)隔化效應(yīng)、刺激抗氧化系統(tǒng)等限制重金屬在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)移[19-20]。Si、NO能有效緩解重金屬脅迫對(duì)植物的傷害，這已在小麥[21-22]、水稻[23-24]、玉米[25-26]等多種植物中得到證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)，外源Si、NO能夠減輕Cu脅迫對(duì)小麥幼苗根系形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)元素含量、葉片葉綠素含量及Fv/Fm的影響從而緩解Cu脅迫對(duì)小麥造成的傷害，這與前人[21-22]研究結(jié)果相似。此外，比較發(fā)現(xiàn)，Si對(duì)Cu脅迫下小麥幼苗整體生長(zhǎng)的緩解效果強(qiáng)于NO。

根系是最先接觸重金屬的部位，當(dāng)重金屬對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用時(shí)，首先會(huì)表現(xiàn)在根部的生理和形態(tài)改變上[27]。本研究結(jié)果表明，Cu脅迫下加入外源Si、NO能夠提高小麥根長(zhǎng)、根表面積、根體積和根系活力等，說(shuō)明Si、NO可減輕Cu脅迫對(duì)小麥根系的損傷。LI等[28]研究表明，Si可緩解鉛(Pb)脅迫對(duì)香蕉的脅迫傷害，與本研究結(jié)果類似，這可能是Si處理下，硅酸根離子能與重金屬離子形成硅酸鹽復(fù)合物，減少游離的重金屬離子，影響植物對(duì)重金屬的吸收，從而有效緩解重金屬對(duì)植物的脅迫傷害。但有研究發(fā)現(xiàn)，NO可促進(jìn)擬南芥根部對(duì)Cd的吸收，提高重金屬毒性，這可能是由于Cd能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生有害的內(nèi)源NO[29]。而本研究中外源NO在植物體內(nèi)能夠通過信號(hào)分子刺激內(nèi)源激素的產(chǎn)生促進(jìn)根系生長(zhǎng),緩解Cu脅迫對(duì)小麥造成的傷害，造成前后結(jié)果不同的原因可能與重金屬種類有關(guān)。

礦質(zhì)元素不僅是植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的組成成分，還是植物生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)者，調(diào)節(jié)電化學(xué)作用，維持離子濃度的平衡、膠體的穩(wěn)定和電荷中和等[30]。Cu脅迫能導(dǎo)致植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的積累和運(yùn)輸發(fā)生變化，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)元素失衡，代謝紊亂。本研究發(fā)現(xiàn)，Cu脅迫總體上導(dǎo)致小麥幼苗根部Ca、K、Mg、Na、Mn、Zn含量顯著降低，這與張義凱等[31]Cu脅迫降低番茄根系中Ca、K、Zn含量的研究結(jié)果一致，但Mn含量的變化不同，這可能與植物種類、Cu濃度、處理時(shí)間不同有關(guān)。研究表明，Cu脅迫下添加Si或NO能降低擬南芥、番茄體內(nèi)Cu含量，增加微量元素含量[32-34]。這與本研究添加Si、NO總體上可增加Ca、K、Mg、Na、Mn、Zn等元素的含量，降低Cu含量的研究結(jié)果相似。這可能是添加外源Si后，硅酸根離子與Cu離子形成不易被植物吸收的硅酸化合物，或Cu離子在植物體內(nèi)代謝活性較低的細(xì)胞區(qū)室中螯合，減弱Cu與其他營(yíng)養(yǎng)元素的競(jìng)爭(zhēng)性吸收[32-33]。而NO則通過影響細(xì)胞壁成分，如果膠、纖維素等促使Cu離子在細(xì)胞壁積累，或促使Cu離子向液泡中轉(zhuǎn)移，調(diào)控質(zhì)膜上 ATPase 等功能蛋白活性、誘導(dǎo)基因表達(dá)等，提高Cu 脅迫下小麥根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，從而緩解Cu的毒害[34]。此外，元素之間的拮抗或協(xié)同作用也在一定程度上調(diào)節(jié)了Cu脅迫對(duì)小麥的影響。

光合作用是植物積累干物質(zhì)的基礎(chǔ)，葉綠素是參與光合作用光能吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化的重要色素，其含量的高低直接反映光合作用的強(qiáng)弱，葉綠素含量降低是植物受重金屬毒害的重要特征[35]。葉綠素?zé)晒饽軌蚩焖贆z測(cè)完整植株在脅迫下的光合作用，可用來(lái)評(píng)價(jià)光合機(jī)構(gòu)的功能及環(huán)境脅迫對(duì)其的影響[36]，F(xiàn)v/Fm是直接反映葉片葉綠素?zé)晒馓匦缘闹笜?biāo)。本研究結(jié)果表明，Cu脅迫下小麥葉綠素含量、Fv/Fm顯著下降，添加外源Si、NO后則顯著提高。研究發(fā)現(xiàn)，Si能通過刺激植物的抗氧化系統(tǒng)減輕Cd脅迫對(duì)植物光合作用的毒害[37]；NO可以促進(jìn)植物體中形成抗氧化劑而提高重金屬脅迫條件下的光合作用[38]，這均與本研究結(jié)果相似。這可能是重金屬脅迫降低葉綠素含量，使捕獲和傳遞給PSⅡ反應(yīng)中心的光能減少、電子傳遞受阻[39]，Si、NO通過減輕重金屬脅迫下小麥的氧化脅迫來(lái)維持細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，減輕植物葉綠體的損傷，從而保證光合作用的正常進(jìn)行。