止吐復(fù)方納米乳的制備及其體外透皮性能研究

馬天偉，趙子明

(徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 徐州 221004)

半數(shù)以上孕婦在妊娠早期會(huì)出現(xiàn)早孕反應(yīng)，包括頭暈、嗜睡、食欲缺乏、厭惡油膩、惡心、嘔吐等。由于孕婦身體內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化，危及母嬰生命安全[1]。復(fù)方止吐納米乳處方來(lái)源于臨床驗(yàn)方，其方藥包括丁香、半夏、陳皮和生姜。丁香能促進(jìn)胃液分泌、增強(qiáng)消化能力、減輕惡心嘔吐；生姜有增強(qiáng)胃功能的效用；而陳皮、半夏可改善脾臟及人體內(nèi)環(huán)境[2-5]。

納米乳是一種由表面活性劑、助表面活性劑、油相、水相4個(gè)組分組成的透明或半透明的分散系統(tǒng)，粒徑為1～100 nm。選擇納米乳作為止吐復(fù)方劑型的優(yōu)勢(shì)主要在于可以提高止吐復(fù)方中難溶性成分的溶解度，減少藥物的刺激性；制備工藝技術(shù)較簡(jiǎn)單，制劑質(zhì)量穩(wěn)定；納米乳制劑的分子粒徑小，分散度較高，具有良好的膜通透性，有助于藥物的透皮吸收[6-11]。

目前該止吐復(fù)方的劑型是將藥物細(xì)粉與賦形劑調(diào)成膏狀，敷貼使用。該劑型的藥物有效成分透皮量與療效并不理想。本研究在尊重原組方的基礎(chǔ)上，采用現(xiàn)代藥物制劑新技術(shù)制成質(zhì)量穩(wěn)定、透皮速率快、生物利用度高的納米乳制劑，為提高該止吐復(fù)方的透皮生物利用度及進(jìn)一步的新藥開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試藥 RCT basic磁力加熱攪拌器(德國(guó)IKA公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000A(上海亞榮生化儀器廠)，SB-5200D超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，NICOMP 380ZLS納米粒度及Zeta電位檢測(cè)儀(美國(guó)PSS公司)，Primaide型高效液相色譜儀(日本日立公司)，RYJ-6B型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)，PHS-3E型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

止吐復(fù)方粉末(徐州市婦幼保健院)，丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，合肥博美生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：BZP0074)，卡必醇(純度99%，山東優(yōu)索化工科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：049601001100)，薄荷油(食品級(jí)，山東優(yōu)索化工科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：049903001100)，肉豆蔻酸異丙酯(isopropyl myristate，IPM)(純度99%，山東優(yōu)索化工科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：049903001100)，聚乙二醇-40氫化蓖麻油(polyethylene glycol-40 hydrogenated castor oil，RH40)(純度99%，山東優(yōu)索化工科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：059212010090)，乳化劑聚氧乙烯辛基苯酚醚-10(polyoxyethylene octylphenol ether，OP-10)(純度99%，山東優(yōu)索化工科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：059102007100)，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)400(純度99%，山東優(yōu)索化工科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：059701011160)，橄欖油(食品級(jí)，山東優(yōu)索化工科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：069905014030)，油酸(純度99%，山東優(yōu)索化工科技有限公司，批號(hào)：049896001111)，1,2-丙二醇(食品級(jí)，山東優(yōu)索化工科技有限公司，批號(hào)：069803001430)，鯨蠟硬脂醇聚氧乙烯醚20(平平加O-20)(純度99%，山東優(yōu)索化工科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：039299001030)，其余試劑為分析純。

健康雌性清潔級(jí)小鼠30只，來(lái)自徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2015-0009。

1.2止吐復(fù)方納米乳的制備工藝研究

1.2.1止吐復(fù)方提取物的制備 按照已確定的工藝制備止吐復(fù)方提取物：稱取適量止吐復(fù)方中藥粉末，以70%乙醇為提取溶劑，按料液比1∶10加入，70 ℃回流提取2次，每次1.5 h；提取液放入4 ℃的冰箱靜置12 h，減壓過(guò)濾，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上45 ℃濃縮至原體積的1/5，濃縮液冷凍干燥得止吐復(fù)方提取物。

1.2.2止吐復(fù)方納米乳的制備方法 精密稱取適量油相與止吐復(fù)方提取物，置磁力攪拌器上攪拌均勻，按一定質(zhì)量比精密稱取適量表面活性劑和助表面活性劑加入混合液中攪拌均勻，然后邊攪拌邊向混合體系中緩慢滴加水相，直至形成澄清透明、流動(dòng)性好的納米乳。

1.2.3處方的篩選 油相的篩選：在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，在IPM、薄荷油、橄欖油、油酸中進(jìn)行篩選。乳化劑的篩選：在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究在RH40、OP-10、平平加O-20等表面活性劑中進(jìn)行篩選。助乳化劑的篩選：為了形成更小的納米乳乳滴，用助乳化劑可調(diào)節(jié)乳化劑的親水親油平衡值(hydrophile-lipophile balance，HLB)值。本實(shí)驗(yàn)在PEG400、1,2-丙二醇、卡必醇中進(jìn)行篩選。

1.2.4偽三元相圖的繪制 精密稱取適量油相與止吐復(fù)方提取物，置磁力攪拌器上攪拌均勻，按乳化劑與助乳化劑的質(zhì)量比(Km值)為 1∶1、2∶1、3∶1均勻混合制成4種混合乳化劑，然后按照質(zhì)量比為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的比例精密稱取一定量的混合乳化劑加入混合液中攪拌均勻，然后邊攪拌邊向混合體系中緩慢滴加水相，詳細(xì)記錄各種狀態(tài)變化時(shí)的耗水量，計(jì)算油相、水相、混合乳化劑所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w/w)。根據(jù)油、水、混合乳化劑在臨界點(diǎn)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，采用Origin 9.0繪制偽三元相圖，確定形成納米乳的區(qū)域，形成納米乳的區(qū)域越大，納米乳越穩(wěn)定。

1.3止吐復(fù)方納米乳的理化性質(zhì)與穩(wěn)定性考察 取不同批次納米乳樣品，采用pH計(jì)測(cè)定其pH值，用旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測(cè)定其黏度，用激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑分布與zeta電位。

將止吐復(fù)方納米乳以13 000×g速度離心20 min，觀察納米乳是否出現(xiàn)沉淀、分層。渾濁等外觀現(xiàn)象[12]。

1.4止吐復(fù)方中丁香酚含量的體外測(cè)定方法研究

1.4.1高效液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)色譜條件色譜柱：WondaSil C18 WR(4.6 mm×25 cm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.01%三氟乙酸(65∶35)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，甲醇溶解并定容至50 mL，制成100 μg/mL丁香酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后用甲醇稀釋該溶液，制成濃度分別為1、2、5、10、20、50 μg/mL的對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度分別吸取20 μL進(jìn)樣，測(cè)得峰面積。以濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.4.3專屬性實(shí)驗(yàn) 取制備好的止吐復(fù)方納米乳5 mL置于50 mL量瓶中，加入30 mL甲醇破乳，超聲10 min，用甲醇稀釋至刻度，過(guò)0.22 μm微孔濾膜得止吐復(fù)方樣品溶液。取空白納米乳5 mL置于50 mL量瓶中加入30 mL甲醇破乳，超聲10 min，用甲醇稀釋至刻度，過(guò)0.22 μm微孔濾膜得空白納米乳溶液。

按照標(biāo)題1.4.1的色譜條件，分別測(cè)定止吐復(fù)方樣品溶液與空白納米乳溶液，分析該檢測(cè)條件的專屬性。

1.4.4穩(wěn)定性考察 精密稱取丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品，配成 50 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，于 0、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積值。

1.4.5日內(nèi)、日間精密度實(shí)驗(yàn) 精密度實(shí)驗(yàn)：取2、5、10 μg/mL的丁香酚對(duì)照品，分別于日內(nèi)0、6、12 h和日間1、2、3 d測(cè)定其峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)測(cè)濃度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD%)。

1.5體外透皮實(shí)驗(yàn) 取健康小鼠30只，涂抹脫毛膏，刮去腹部毛發(fā)，溫水洗凈，靜養(yǎng)1 d后用頸椎脫位法處死，立即剝離腹部皮膚，去除脂肪及皮下組織，用0.9%氯化鈉溶液洗凈，放入2～8 ℃冰箱中備用。

采用Franz擴(kuò)散池，有效滲透面積為2.27 cm2，接收介質(zhì)為含25%無(wú)水乙醇的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，接收池體積為8 mL。分別取止吐復(fù)方納米乳 1 mL與止吐復(fù)方原劑型膏狀物0.1 g置于供給池中，在(37±1)℃、300 r/min攪拌條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別于1、2、4、6、8 h取出1 mL接收液(同時(shí)補(bǔ)充同溫等量接收介質(zhì))，13 000×g離心10 min，取上清液，HPLC測(cè)定。計(jì)算單位面積累積經(jīng)皮滲透量Qn和累積滲透百分率P。Qn=(CnVn+∑CiVi)/A；P=Qn/Qs×100%。公式中Cn為第n個(gè)取樣點(diǎn)藥物的校正濃度，Ci是第i個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物濃度，Vn和 Vi分別是接收池的體積(8 mL)和取樣體積(1 mL)，A是擴(kuò)散池的擴(kuò)散面積(A=2.27 cm2)，Qs是供給池中丁香酚質(zhì)量。體外透皮實(shí)驗(yàn)按不同處方分組，混合乳化劑/油相=9∶1,7.5∶1,6∶1；B∶Km=3∶1,2∶1,1∶1；C：油相為薄荷油與IPM。其中平行操作次數(shù)為3次。

2 結(jié) 果

2.1止吐復(fù)方納米乳的制備工藝研究

2.1.1油相的初步篩選 油酸和橄欖油溶解止吐復(fù)方提取物時(shí)無(wú)法形成透明的液體，而是變得渾濁或分層，故排除這兩種油相。IPM和薄荷油對(duì)止吐復(fù)方提取物均有較好的溶解性能，故初步確定以IPM和薄荷油為納米乳油相的選擇。

2.1.2乳化劑的篩選 繪制油相為IPM，助表面活性劑為卡比醇，Km值為2∶1時(shí)，乳化劑分別為RH40、OP-10、平平加O-20的偽三元相圖，見(jiàn)圖1。以RH40、OP-10、平平加O-20為乳劑均能形成納米乳，其中以RH40所形成的納米乳區(qū)域最大，故選擇RH40作為納米乳的表面活性劑。

2.1.3助乳化劑的篩選 繪制油相為IPM，表面活性劑為RH40，Km為2∶1時(shí)，助表面活性劑分別為卡比醇、1,2-丙二醇、PEG400的偽三元相圖，見(jiàn)圖2。以卡必醇、1,2-丙二醇、PEG400為助表面活性劑均能形成納米乳，其中以卡必醇所形成的納米乳區(qū)域最大，故選擇卡必醇作為納米乳的助乳化劑。

2.1.4Km值的篩選 繪制油相為IPM，乳化劑為RH40，助乳化劑為卡比醇，乳化劑與助乳化劑的比例Km值分別為1∶1、2∶1、3∶1時(shí)的偽三元相圖，見(jiàn)圖3。在RH40-卡比醇-IPM混合油-水體系中，當(dāng)Km為2∶1時(shí)所形成的納米乳區(qū)域最大，故確定Km=2∶1。

1A：RH40(聚乙二醇-40氫化蓖麻油)；1B：OP-10(聚氧乙烯辛基苯酚醚-10)；1C：平平加O-20(鯨蠟硬脂醇聚氧乙烯醚20)

圖1 乳化劑對(duì)納米乳區(qū)域的影響

2.1.5油相的進(jìn)一步篩選 繪制乳化劑為RH40，助乳化劑為卡比醇，Km=2∶1時(shí)，油相分別為IPM和薄荷油的偽三元相圖，見(jiàn)圖4。當(dāng)乳化劑為RH40、助乳化劑為卡比醇、Km=2∶1時(shí)，油相為薄荷油形成的納米乳區(qū)域面積大于IPM形成的納米乳區(qū)域面積。同時(shí)，油相為薄荷油的納米乳熱力學(xué)穩(wěn)定性優(yōu)于油相為IPM的納米乳。因此，選擇薄荷油作為止吐復(fù)方納米乳的油相。偽三元相圖確定的優(yōu)化處方將通過(guò)體外透皮實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2止吐復(fù)方納米乳的理化性質(zhì)與穩(wěn)定性考察 止吐復(fù)方納米乳的pH值為6.3±0.2，處于人體皮膚pH范圍內(nèi)，刺激性小；止吐復(fù)方納米乳的黏度為(5.18±0.13)mPa·s，具有比水更高的黏度；止吐復(fù)方納米乳的粒徑為(26.5±5.6)nm，符合納米乳的粒徑范圍；zeta電位為-0.73±0.24，接近中性。高速離心實(shí)驗(yàn)表明，本研究制備的止吐復(fù)方納米乳在13 000×g離心20 min，納米乳仍為淡褐色透明均一體系，未出現(xiàn)沉淀、分層、渾濁等現(xiàn)象。

2.3止吐復(fù)方中丁香酚含量的體外測(cè)定方法研究 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=75 665.2C+3 549.2，r=0.998,P<0.01，線性范圍為1～50 μg/mL。納米乳成分對(duì)丁香酚的測(cè)定無(wú)干擾(圖5)。穩(wěn)定性考察的RSD 值為1.42%。HPLC法測(cè)定的日內(nèi)精密度分別為0.40%、0.37%、0.82%，日間精密度分別為1.42%、1.84%、1.88%。

2.4體外透皮實(shí)驗(yàn) 當(dāng)納米乳中混合乳化劑使用比例增加時(shí)，納米乳的透皮效果會(huì)隨之增加(圖6A)；Km=2∶1和3∶1時(shí)累積透皮吸收率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均顯著優(yōu)于Km=1∶1的納米乳(P<0.05)(圖6B)；薄荷油作為油相的止吐復(fù)方納米乳的透皮吸收優(yōu)于IPM(P<0.05)(圖6C)。

3 討 論

非離子型表面活性劑的毒性和刺激性較小，pH等外界因素對(duì)其影響較小，常被用于納米乳的制備。制備O/W型納米乳的乳化劑的HLB值為8～18[13]。本研究選用的3種非離子表面活性劑RH-40(HLB=13～14)、OP-10(HLB=14.5)、平平加0-20(HLB=16.5)均在此范圍內(nèi)。其中RH-40與OP-10 形成的納米乳區(qū)域較大，可能是由于兩者的HLB值與所用的油相IPM所需的HLB值(12.0)更匹配，乳化效果好。研究發(fā)現(xiàn)，只有乳化劑參與形成的納米乳不夠穩(wěn)定，需要助乳化劑的參與才能使納米乳更加穩(wěn)定[14]。王晶等[15]以RH40為乳化劑，Labrafil M1994 CS為油相，Km為2∶1時(shí)，比較了乙醇、丙二醇、正丁醇作為助乳化劑的偽三元相圖，發(fā)現(xiàn)醇的親脂性越強(qiáng)，偽三元相圖中的納米乳區(qū)域面積越大。本研究中卡必醇作為助乳化劑優(yōu)于1,2-丙二醇和PEG400,這可能是由于卡必醇既溶于水，又具有一定的親脂性，提高了界面膜的柔順性和牢固性，降低了體系的黏度，有助于O/W型納米乳的形成?；旌先榛瘎┲腥榛瘎┖椭榛瘎┰谧钸m宜的比例中才能使形成的界膜既有一定的剛性，也有一定的柔性。本研究中，Km=1∶1時(shí)，乳化劑用量較少，乳化能力較弱，納米乳區(qū)域較??；Km=2∶1時(shí)，兩者的配比達(dá)到最佳狀態(tài)，助乳化劑較好地鑲嵌在乳化劑中有利于納米乳的穩(wěn)定；如乳化劑的量繼續(xù)增加，助乳化劑的量相對(duì)減少，也無(wú)法實(shí)現(xiàn)最佳乳化效果。體外透皮實(shí)驗(yàn)的皮膚模型通常是用動(dòng)物皮膚代替人的皮膚來(lái)進(jìn)行。雖然乳豬和猴子皮膚對(duì)某些藥物的透過(guò)性能與人皮膚相似，但因?yàn)閬?lái)源不易，未得到推廣。目前使用較多的是4～7周齡的小鼠皮膚，其與人皮膚結(jié)構(gòu)基本一致，且毛孔密度較接近，也容易獲得[16-17]。接收液會(huì)影響藥物的穩(wěn)態(tài)累積滲透速率[18]，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中接收液的選擇至關(guān)重要。有效成分透過(guò)鼠皮后應(yīng)能完全溶解于接收液，并且其在接收液中的濃度遠(yuǎn)小于該成分的飽和濃度才能促使有效成分不斷透過(guò)皮膚。止吐復(fù)方提取物中脂溶性成分較多，因此需加入一些醇類或其他非離子表面活性劑以提高其溶解度[19-20]。本研究考察了含5%～30%乙醇的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)對(duì)脂溶性指標(biāo)成分丁香酚的溶解度，發(fā)現(xiàn)含25%乙醇的磷酸鹽緩沖液可以滿足漏槽條件，因此采用含25%乙醇的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)溶液作為接收介質(zhì)。

2A：卡必醇；2B：1,2-丙二醇；2C：PEG(聚乙二醇)400

3A：Km=3∶1；3B：Km=2∶1；3C：Km=1∶1

4A：IPM(肉豆蔻酸異丙酯)；4B：薄荷油

5A：空白納米乳；5B：丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品；5C：止吐復(fù)方納米乳

6A：混合乳化劑/油相=9∶1,7.5∶1,6∶1；6B：Km=3∶1,2∶1,1∶1；6C：油相為薄荷油和IPM；*8 h時(shí)混合乳化劑/油相=9∶1與混合乳化劑/油相=7.5∶1比較，P<0.05；#8 h時(shí)混合乳化劑/油相=9∶1與混合乳化劑/油相=6∶1組比較，P<0.05；△8 h時(shí)Km=2∶1組與Km=1∶1組比較，P<0.05；▲8 h時(shí)薄荷油組與IPM組比較，P<0.05

圖6 不同處方納米乳透皮試驗(yàn)結(jié)果

透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)納米乳中混合乳化劑使用比例增加時(shí)，納米乳的透皮效果會(huì)隨之增加。這是由于乳化劑/助乳化劑能夠短暫打開皮膚屏障的緊密連接，具有良好的促進(jìn)滲透作用，但隨著其用量的增加，也可能產(chǎn)生一定的刺激性，故需在保證安全性的前提下優(yōu)化混合乳化劑用量。Km=2∶1和3∶1的透皮效果優(yōu)于Km=1∶1，表明在混合乳化劑中主乳化劑對(duì)增加透皮吸收發(fā)揮更關(guān)鍵的作用。本研究中薄荷油為油相的透皮轉(zhuǎn)運(yùn)效果強(qiáng)于IPM，可能由于薄荷油本身就是一種透皮吸收促進(jìn)劑，利于藥物透過(guò)細(xì)胞間隙透皮擴(kuò)散[21]。

綜上所述，結(jié)合偽三元相圖與體外透皮吸收的結(jié)果，本研究確定的止吐復(fù)方納米乳最佳處方為油相采用薄荷油，乳化劑采用RH40，助乳化劑采用卡比醇，Km=3∶1，混合乳化劑與油相的比例為9∶1。采用該處方制備的止吐復(fù)方納米乳制劑的體外透皮效果相比原劑型有了顯著的增強(qiáng)，為該類型中藥復(fù)方制劑的新型透皮給藥系統(tǒng)研發(fā)提供了新思路。