日本血吸蟲多肽SJMHE1對關節(jié)炎小鼠的毒副反應檢測

王 鈞,汪雪峰

(1.鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002；2.江蘇大學附屬醫(yī)院中心實驗室，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

“衛(wèi)生假說”認為，目前發(fā)達國家自身免疫或過敏性疾病的增加與環(huán)境衛(wèi)生條件的改善、抗生素的大量使用等導致其幼年時獲感染的概率下降密切相關[1]。流行病學調查顯示，病原體感染特別是蠕蟲感染與自身免疫或過敏性疾病存在相反的關系，蠕蟲感染的流行區(qū)，自身免疫或過敏性疾病的發(fā)病率較低，反之亦然[2]。從史前木乃伊中發(fā)現(xiàn)的蠕蟲證實了蠕蟲感染參與人類的整個進化過程[3-4]。與人類共進化的蠕蟲可通過抑制宿主的免疫反應達到長期寄生的目的，為自身免疫或哮喘等炎癥性疾病的治療提供了新的研究方向。近年來研究發(fā)現(xiàn)，蠕蟲感染或蠕蟲來源的免疫調節(jié)分子可預防或治療多種自身免疫或過敏性疾病的模型小鼠，如1型糖尿病、炎性腸病、哮喘等[5]。本研究前期實驗發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲來源多肽SJMHE1可抑制小鼠遲發(fā)性超敏反應[6-8]，減輕膠原誘導的關節(jié)炎小鼠的炎癥反應[9]。因此，具有抗炎效應的此日本血吸蟲來源多肽具有廣泛的臨床應用前景，本研究主要檢測該小分子多肽注射到關節(jié)炎小鼠后可能的毒副反應，為今后的臨床轉化提供必要的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 60只6～8周齡的雄性DBA/1小鼠購自南京大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(蘇)2010-0001。小鼠均在江蘇大學實驗動物中心飼養(yǎng)，無特定病原體級管理。所有動物實驗遵照江蘇大學動物保護和使用委員會指南及協(xié)議。SJMHE1、卵清蛋白323-339多肽(ovalbumin,OVA323-339)購自中國淘普生物公司；牛 Ⅱ 型膠原購自美國BD Bioscience公司；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑購自美國Sigma公司；結核分枝桿菌購自美國Difco公司。

1.2方法

1.2.1建立膠原誘導的關節(jié)炎小鼠(collagen-induced arthritis，CIA)模型 參照文獻[9]的研究，200 μg牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑等量混合，制成乳化劑，在0、21 d尾根部皮下免疫DBA/1小鼠，共免疫2次。完全弗氏佐劑由不完全弗氏佐劑中加4 mg/mL的結核分枝桿菌H37RA配制，并經關節(jié)炎癥的臨床評分及組織學鑒定，驗證CIA小鼠的構建成功。

1.2.2CIA的臨床評定 每天監(jiān)測小鼠關節(jié)炎的癥狀，觀察到一個腳爪出現(xiàn)紅斑或腫脹，視為關節(jié)炎開始發(fā)病，并進行臨床評分，關節(jié)炎的嚴重程度分0～3個等級：0級為無改變，1級為輕微腫脹和(或)紅斑，2級為中度腫脹和紅斑，3級為顯著的腫脹和紅斑；根據(jù)4個腳爪的炎癥狀況，每只小鼠最高評分為12分[9]。

1.2.3組織學鑒定 在牛Ⅱ型膠原免疫的第55天，分離各治療組小鼠的膝關節(jié)，10%的甲醛固定24 h后，用5%的三氯乙酸脫鈣7 d，然后脫水，石蠟包埋，制成3～4 μm的切片，蘇木精-伊紅染色后顯微鏡檢查組織學改變。

1.2.4SJMHE1處理CIA小鼠 60只小鼠依據(jù)隨機數(shù)字法分為Naive組、SJMHE1組、OVA323-339組、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)組及 CIA組，每組12只；將10 μg SJMHE1、10 μg OVA323-339、PBS與完全弗氏佐劑等量混合，制成乳化劑，尾脊部皮下注射小鼠，注射劑量100 μL/只；在牛Ⅱ型膠原免疫的第7天進行小鼠皮下免疫，每隔14天免疫一次，共注射3次。

1.2.5小鼠血細胞、血清生化指標測定 在SJMHE1皮下免疫8周后，小鼠眶內眥取血進行白細胞計數(shù)和血清生化指標檢測，包括小鼠肝臟功能指標(丙氨酸轉氨酶與天冬氨酸轉氨酶)和腎臟功能指標(尿素氮、尿肌酐)，采用日本奧林巴斯Au2700全自動生化儀進行檢測。

1.2.6小鼠組織病理切片觀察 分離各處理組小鼠肝臟、腎臟、肺臟、心臟，隨即放入裝有10%甲醛固定液的標本瓶中浸泡固定48 h后做病理組織學檢查，蘇木精-伊紅染色，光鏡觀察各個器官組織形態(tài)學變化。

2 結 果

2.1CIA小鼠關節(jié)炎癥的病理改變 OVA323-339組、PBS組和CIA組小鼠的腳爪病理出理大量炎癥細胞浸潤，滑膜增生，關節(jié)間隙明顯變窄，有血管翳，軟骨有侵蝕和破壞；但SJMHE1處理小鼠關節(jié)炎癥細胞的浸潤及軟骨破壞最輕，與Naive組小鼠相同，其關節(jié)滑膜完整，滑膜細胞1～2層，排列整齊，軟骨完整。見圖1。

Naive:正常對照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸鹽緩沖液；CIA：膠原誘導的關節(jié)炎

2.2SJMHE1處理對白細胞計數(shù)的影響 Naive組、SJMHE1組、OVA323-339組、PBS組、CIA組白細胞計數(shù)分別為(1.85±0.07)×109/L、(1.95±0.21)×109/L、(4.12±1.13)×109/L、(3.70±1.11)×109/L、(5.10±1.27)×109/L，各組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=14.320,P<0.01)，OVA323-339組、PBS組、CIA組小鼠的白細胞計數(shù)高于Naive組(P<0.05)，但SJMHE1組白細胞計數(shù)與Naive組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3SJMHE1處理對小鼠血清生化指標的影響 各組小鼠ALT、AST、BUN、Cr比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

2.4SJMHE1處理對主要臟器的影響 Naive組、SJMHE1組、OVA323-339組、PBS組及CIA組小鼠肝小葉結構清晰完整，肝細胞形態(tài)結構正常(圖2)；各組小鼠腎臟結構正常，可見泌尿小管、少量血管神經等構成的腎間質，腎小管上皮細胞完整(圖3)；各組小鼠肺組織中肺泡結構完整，肺泡腔和支氣管干凈，有少量紅細胞(圖4)；各組小鼠心肌組織結構完整、清晰，心肌纖維細長，心肌纖維間有少量組織(圖5)；SJMHE1處理未見小鼠肝臟、腎臟、肺臟、心臟出現(xiàn)異常。

表1 各組小鼠血清生化指標比較

Naive:正常對照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸鹽緩沖液；CIA：膠原誘導的關節(jié)炎

Naive:正常對照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸鹽緩沖液；CIA：膠原誘導的關節(jié)炎

Naive:正常對照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸鹽緩沖液；CIA：膠原誘導的關節(jié)炎

Naive:正常對照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸鹽緩沖液；CIA：膠原誘導的關節(jié)炎

Naive:正常對照；OVA323-339：卵清蛋白323-339多肽；PBS：磷酸鹽緩沖液；CIA：膠原誘導的關節(jié)炎

3 討 論

蠕蟲感染或蠕蟲來源的免疫調節(jié)分子可抑制多種自身免疫、過敏等炎癥反應。如曼氏血吸蟲、蛔蟲的磷脂酰絲氨酸[10]、魏氏棘唇線蟲的排泄-分泌物ES-62等均可以通過Toll樣受體抑制血友病A、關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、哮喘等[11-14]。但目前大多數(shù)已鑒定出的蠕蟲免疫調節(jié)分子多為蛋白大分子、糖脂、糖蛋白混合物，具有潛在的免疫原性副反應[15-16]。血吸蟲感染也可加劇過敏性疾病的發(fā)病，除血吸蟲感染可誘導Th2細胞極化反應外，血吸蟲本身含有的過敏原也可加劇過敏性疾病的發(fā)病[17-18]。因而，為了減少蠕蟲分子抗炎治療帶來的不良反應，一些研究者開始尋求蠕蟲分子的小分子類似物，如來自ES-62的小分子類似物已被證明可抑制哮喘和關節(jié)炎等[14,19-20]。與上述尋求蠕蟲小分子類似，本課題組致力于尋求蠕蟲抗原的小分子多肽，期待其具有抗炎效應的同時，提高治療過程中的安全性。

另外，類風濕關節(jié)炎是一種慢性炎癥性疾病，影響全球約1%的人口，我國發(fā)病率為0.3～0.5%，類風濕關節(jié)炎的致殘率較高，未經治療的類風濕關節(jié)炎患者2～3年致殘率高達70%[21]，由此造成喪失勞動能力的人群高達千余萬，已成為一種嚴重威脅人類健康的疾病。類風濕關節(jié)炎的主要病理特征為滑膜增生，炎癥細胞浸潤、血管翳形成，關節(jié)軟骨及軟骨下破壞等。目前類風濕關節(jié)炎的臨床治療仍以非甾體抗炎藥物和慢作用抗風濕藥物為主，糖皮質激素和細胞毒免疫抑制劑也較常用，這些藥物均有一定療效，但由于不良反應較大，患者難以長期服用。因此，急需尋求新的特異性作用靶點或新的干預手段對類風濕關節(jié)炎患者進行治療，開發(fā)毒性小且能有效治療的藥物不僅具有重要的社會效益，還將產生重大的經濟效益。

目前關于蠕蟲感染或蠕蟲產物治療關節(jié)炎的報道也較多，如日本血吸蟲感染可抑制小鼠膠原誘導的關節(jié)炎的發(fā)生，減輕關節(jié)炎的臨床癥狀，減少滑膜增生，減少滑膜炎癥細胞的浸潤，減少血管翳的形成及破骨細胞活化，減少關節(jié)破壞[22]。旋毛蟲感染的小鼠膠原誘導關節(jié)炎的發(fā)生率明顯降低；旋毛蟲感染可經程序性細胞死亡受體1介導，減少致炎性Th1/Th17細胞反應，顯著減輕小鼠關節(jié)炎的病理改變[23]；豬蛔蟲的提取物口服或皮下注射，也可抑制小鼠酵母聚糖和膠原誘導的關節(jié)炎的發(fā)生，減少軟骨增生及破壞[24]。因為蠕蟲感染易引起較多的不良反應，更多的研究者也在關注蠕蟲分子對關節(jié)炎的抑制效應，其中研究最多、最廣泛是魏氏棘唇線蟲的ES-62，ES-62可通過調節(jié)腸道微生物和腸黏膜屏障的完整[11]，抑制Th17和γδT細胞依賴的白細胞介素-17產生，抑制小鼠膠原誘導的關節(jié)炎的發(fā)生[25]；由于ES-62為大分子，為了減少大分子可能的免疫原性不良反應，其小分子類似物也被證明可抑制炎癥性關節(jié)炎和破骨細胞生成[19]。因為目前尚未發(fā)現(xiàn)蠕蟲來源多肽在關節(jié)炎小鼠中的毒副反應檢測，本研究對關節(jié)炎小鼠的安全性檢測參照藥物或疫苗的檢測指標及方法[26-27]。本研究結果顯示，關節(jié)炎小鼠的腳爪病理出理大量炎癥細胞的浸潤，滑膜增生，關節(jié)間隙明顯變窄，有血管翳，軟骨有侵蝕和破壞，說明關節(jié)炎小鼠模型構建成功，但SJMHE1處理的小鼠關節(jié)炎癥細胞的浸潤及軟骨破壞最輕，與Naive組小鼠類似，關節(jié)滑膜仍保持完整。該結果與小鼠白細胞計數(shù)結果一致，與OVA323-339、PBS及CIA組小鼠相比，小鼠皮下注射血吸蟲多肽SJMHE1，可明顯減少外周血中白細胞計數(shù)，表明SJMHE1可抑制關節(jié)炎小鼠的炎癥反應；與Naive組小鼠相比，SJMHE1處理不會引起肝、腎主要生化酶學的升高，表明SJMHE1處理不會引起明顯的肝、腎功能損害；同時，不會引起小鼠主要臟器肝臟、腎臟、肺臟、心臟組織的病理學改變。全程無小鼠死亡，未見小鼠攝食減少、體重下降等不良反應，表明該小分子多肽具有應用的安全性，可為今后進一步開展基于此小分子多肽的治療關節(jié)炎等炎癥性疾病的臨床前研究提供依據(jù)，也為類風濕關節(jié)炎的治療提供新的靶點和依據(jù)。

綜上所述，日本血吸蟲來源多肽SJMHE1可抑制膠原誘導的關節(jié)炎小鼠的炎癥反應，但不影響小鼠的肝、腎功能，對小鼠肝臟、腎臟、肺臟、心臟組織無明顯影響，具有較好的生物安全性。