植物提取液中甲醛脫氫酶的活性及其評價方法?

楊玉霞，梁含笑，蘇玉紅

(新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

“室內(nèi)空氣污染”已成為繼大氣、水體、固體廢棄物、噪聲四大污染之后的我國第五大污染[1,2].甲醛是危害人體健康的首要室內(nèi)空氣污染物[3].低濃度甲醛對眼睛、皮膚和上呼吸道黏膜具有刺激作用，皮膚直接接觸甲醛可引起過敏性皮炎、色斑、皮膚壞死等；吸入高濃度甲醛，可引起鼻咽腫瘤、致癌、致畸等危害[4,5].針對當(dāng)前嚴(yán)重的室內(nèi)空氣污染問題，人們開發(fā)了許多治理技術(shù)，主要有纖維過濾、膜分離凈化、活性炭吸附、靜電補(bǔ)集、光催化分解、低溫等離子體分解和臭氧滅菌消毒等，但這些方法在清除室內(nèi)甲醛污染物的同時存在成本高、裝置復(fù)雜、治標(biāo)不治本、伴生新的污染物等缺點(diǎn)[6?12].與這些技術(shù)相比，植物凈化技術(shù)具有成本低、操作簡單、環(huán)境破壞性小、能耗低、兼顧景觀修飾性和封閉空間內(nèi)氣候調(diào)節(jié)能力等優(yōu)點(diǎn)，因而一經(jīng)提出即受到了民眾的熱烈支持和廣泛認(rèn)同[13?15].

甲醛脫氫酶存在于絕大多數(shù)原核生物以及所有的真核生物中，是一種將甲醛進(jìn)行轉(zhuǎn)換的氧化還原酶[16,17].文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果表明，植物體內(nèi)的甲醛脫氫酶在凈化甲醛的機(jī)理中占據(jù)重要地位[18,19].但目前對植物體內(nèi)甲醛脫氫酶在甲醛凈化中的作用大多源于理論推斷或間接推測，缺乏直接實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，對其活性大小更是缺乏有效的評價手段.鑒于此，本文以常見野生植物（蒲公英）和室內(nèi)花卉（蘆薈、綠蘿、牡丹吊蘭）為植物材料，采用加熱失活的方式去除植物提取液中甲醛脫氫酶的活性，進(jìn)而通過新鮮提取液和失活提取液中加入甲醛前后甲醛含量的差值，計算凈化實(shí)驗(yàn)中不同條件下植物提取液（新鮮或失活）對外加甲醛的凈化能力，對比植物新鮮提取液和失活提取液對外加甲醛凈化能力差異的方式，初步建立了一種用于驗(yàn)證和定量估算植物體內(nèi)甲醛脫氫酶存在及活性大小的簡易、快速、粗略評價方法.研究結(jié)果可為建立深入理解甲醛在植物體內(nèi)的凈化機(jī)制、建立簡便快速的高效凈化植物篩選技術(shù)提供一定科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑：乙酰丙酮（北京市百靈威化學(xué)有限公司）、冰乙酸（天津市百世化工有限公司）、乙酸銨（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）、甲醛（天津市百世化工有限公司）、磷酸二氫鉀（天津永晟精細(xì)化工有限公司）、磷酸氫二鉀（天津永晟精細(xì)化工有限公司），實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.

植物材料：植物幼苗在未受污染的烏魯木齊市采集或購買，仔細(xì)地與土壤分離，用去離子水徹底沖洗，選擇8～10片葉子的均勻苗(葉片大小決定)進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外分光光度（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、HH-WL恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）、BSA224S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）、TDL-50電動離心機(jī)（江蘇金壇儀器廠）、自制玻璃箱（50 cm×30 cm×34 cm），其頂部可以自由打開.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

甲醛溶液的測定方法：參照中華人民共和國國家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)HJ601-2011.

植物提取液的制備：將植物葉片稱重后在低溫保護(hù)下加入20 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.8）為提取劑，研磨、提取、混勻、離心（0～4℃、15 min、4 000 r/min），一份提取液置于0～4℃冰箱中短時間保存、待用，另一份提取液在100℃水浴中加熱10 min后冷卻.

植物的凈化效率：在玻璃密封箱進(jìn)行甲醛的植物葉熏蒸實(shí)驗(yàn)[14].

1.4 數(shù)據(jù)計算與處理

1.4.1 甲醛脫氫酶活性的計算方法

R1=（C0?C1）×5 mL×提取液的總體積/鮮重(mg·kg?1FW）；

R2=（C0?C2）×5 mL×提取液的總體積/鮮重(mg·kg?1FW)；

R=R1?R2(mg·kg?1FW).

R1表示新鮮提取液的凈化能力；R2表示新鮮提取液的凈化能力；R表示甲醛脫氫酶去除甲醛能力；C0表示植物提取液中外加甲醛后的起始濃度值；C1表示新鮮植物提取液中甲醛最終濃度；C2表示失活植物提取液中甲醛最終濃度.

1.4.2 植物的凈化效率

甲醛去除量=（甲醛初始濃度×體積?各時段測定的甲醛濃度×各時段體積）?空白對照；

凈化效率=甲醛去除量/吸收時間/植物鮮重；

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Origin8.0專業(yè)制圖與數(shù)據(jù)分析軟件繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 新鮮提取液對外加甲醛的去除作用

蒲公英葉新鮮提取液中甲醛濃度隨時間的變化曲線如圖1所示.結(jié)果表明，當(dāng)初始濃度為2.78 mg·L?1時，新鮮提取液中甲醛濃度先隨著反應(yīng)時間的增加而迅速降低，3 s后降低到0.57 mg·L?1，隨后基本保持平穩(wěn)，表明新鮮植物提取液中有效成份與甲醛的反應(yīng)可以快速進(jìn)行，短時間內(nèi)（<10 s）即可達(dá)到反應(yīng)平衡.考慮到操作的方便性，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中新鮮植物提取液與外加甲醛的反應(yīng)時間均設(shè)為60 s.

圖1 蒲公英新鮮提取液中甲醛濃度的動態(tài)變化曲線Fig 1 The dynamic change curve of formaldehyde concentration in the extract of fresh Dandelion leaves

圖2 蒲公英新鮮提取液對外加甲醛的降解能力Fig 2 The degradation ability of fresh extract of Dandelion to external formaldehyde

2.2 新鮮提取液對外加甲醛的去除能力

在新鮮提取液中加入甲醛濃度為18.52 mg·L?1、34.48 mg·L?1、41.67 mg·L?1、71.43 mg·L?1、93.75 mg·L?1、111.11 mg·L?1，反應(yīng)1 min后，以外加甲醛濃度為橫坐標(biāo)，去除甲醛能力為縱坐標(biāo)繪制曲線，如圖2所示.發(fā)現(xiàn)蒲公英新鮮提取液對外加甲醛的去除能力，隨著甲醛濃度的增加，蒲公英新鮮提取液去除甲醛能力呈線性增長趨勢，曲線方程R=0.0069c+0.0052，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9991.

2.3 失活植物提取液的制備條件優(yōu)化

將蒲公英新鮮提取液置于100℃的水浴鍋中，提取液中內(nèi)置溫度計.當(dāng)水浴時間為0 min、3 min、7 min、9 min、12 min、16min、20 min、30 min時，讀取植物提取液的溫度，結(jié)果如圖3A所示.同時，測定水浴時間不同時提取液中外加甲醛濃度的變化，計算出提取液去除外加甲醛的能力，結(jié)果如圖3B所示.結(jié)果表明，隨著水浴時間的增加，提取液溫度先迅速增加然后呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢（圖3A）；提取液（反應(yīng)時間均為1 min）去除外加甲醛的能力隨水浴時間增加先迅速增加后趨于平衡（圖3B）.因此，為了降低生產(chǎn)能耗和設(shè)備損耗，提取液的加熱失活時間選為10 min.

圖3 失活時間的選擇Fig 3 Boiling time selection

2.4 失活植物提取液中甲醛濃度的動態(tài)變化曲線

蒲公英失活提取液中外加甲醛溶液后，甲醛濃度的動態(tài)變化如圖4所示.結(jié)果表明，蒲公英失活提取液在外加甲醛后，甲醛濃度在極短時間內(nèi)急劇下降，但由于蒲公英新鮮提取液和失活提取液中外加甲醛的濃度變化差異不大，表明失活提取液中一定存在除酶促作用外的其他去除甲醛機(jī)制.由圖2和圖4可知，加熱前后提取液對外加甲醛的去除反應(yīng)均在60 s內(nèi)可達(dá)平衡，根據(jù)反應(yīng)前后的甲醛濃度差值計算出提取液對外加甲醛的去除能力；再根據(jù)加熱前后去除能力的差異推算出新鮮提取液中甲醛脫氫酶的活性及其大小.

2.5 新鮮提取液中甲醛脫氫酶的活性評價

在蘆薈、綠蘿、牡丹吊蘭葉新鮮和失活提取液中加入甲醛溶液后，甲醛濃度的動態(tài)變化如圖5-7所示.三種植物葉新鮮和失活提取液對空氣中甲醛凈化效率如表1如示.加熱前后蘆薈葉提取液對外加甲醛的去除能力并未顯著減少，表明本文建立的甲醛脫氫酶活性評價方法的系統(tǒng)誤差較小，具有較好的準(zhǔn)確性.

圖4 失活蒲公英提取液中甲醛濃度的動態(tài)變化曲線Fig 4 Dynamic change curve of formaldehyde concentration in boiling Dandelion extracts

圖5 蘆薈提取液中甲醛濃度的動態(tài)變化曲線Fig 5 Dynamic change curve of formaldehyde concentration in extracts of Aloe leaves

當(dāng)反應(yīng)條件相同時，兩種提取液對外加甲醛去除能力的差異主要由甲醛脫氫酶活性大小決定.由表1和圖5-7可知，蘆薈葉提取液中甲醛脫氫酶活性極低，對植物凈化甲醛的貢獻(xiàn)可忽略不計；而牡丹吊蘭葉提取液中甲醛脫氫酶活性較高，其對外加甲醛的去除作用由酶促反應(yīng)主導(dǎo)；綠蘿葉提取液中甲醛脫氫酶活性居于前兩者之間.即三種植物新鮮提取液中甲醛脫氫酶活性大小依次為：牡丹吊蘭>綠蘿>蘆薈.

圖6 綠蘿提取液中甲醛濃度的動態(tài)變化曲線Fig 6 Dynamic change curve of formaldehyde concentration in extracts of Scindapsus aureus leaves

圖7 牡丹吊蘭提取液中甲醛濃度的動態(tài)變化曲線Fig 7 Dynamic change curve of formaldehyde concentration in extract of Aptenia cordifolia leaves

2.6 空氣中甲醛的植物凈化效率

初步驗(yàn)證新建立的評價方法的有效性和可靠性，通過蒲公英、蘆薈、綠蘿、牡丹吊蘭的甲醛熏蒸實(shí)驗(yàn)，并探討了植物中甲醛脫氫酶活性大小對甲醛凈化效率的影響，結(jié)果如表1.當(dāng)空氣中甲醛濃度為0.72 mg·m?3時，24 h內(nèi)三種植物對空氣中甲醛的凈化效率依次為：牡丹吊蘭>綠蘿>蘆薈>蒲公英，與文獻(xiàn)報道一致[20?22]，也與2.5所述的甲醛脫氫酶活性順序一致，表明甲醛脫氫酶是影響植物凈化空氣中甲醛的重要因素.本文建立的植物中甲醛脫氫酶活性大小評價方法簡單、快速、有效，評價結(jié)果可為粗略篩選空氣中甲醛高效凈化植物提供理論依據(jù).

表1 植物對甲醛的凈化效率和甲醛脫氫酶活性Tab 1 Purification efficiency of formaldehyde in air and formaldehyde dehydrogenase activity

3 結(jié)論

(1)本文建立了一種驗(yàn)證和評價植物提取液中甲醛脫氫酶活性的方法.該方法簡單、快速、有效，評價結(jié)果可用于初步篩選空氣中甲醛的高效凈化植物.

(2)實(shí)驗(yàn)條件下，蒲公英、蘆薈、綠蘿、牡丹吊蘭對空氣中甲醛的凈化效率在8.81～29.35 mg·h?1·kg?1FW之間，大小依次為：牡丹吊蘭＞綠蘿＞蘆薈＞蒲公英.

(3)酶促反應(yīng)是植物去除體內(nèi)甲醛的一種重要作用機(jī)制.