我國豬肺炎支原體感染現(xiàn)狀及實驗室檢測技術(shù)研究進(jìn)展

李 嬌，王文秀，李 峰，沈志強(qiáng)，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS），又稱豬地方流行性肺炎（porcine enzootic pneumonia, PEP），俗稱豬喘氣病，是由豬肺炎支原體（Mycoplasmal hyopneumonia, Mhp）引起的以咳嗽、氣喘、生長發(fā)育不良、高發(fā)病率和低死亡率為主要特征的一種慢性、接觸性呼吸道傳染病，該病長期存在并嚴(yán)重威脅著我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展[1-2]。豬肺炎支原體常常與多殺性巴氏桿菌、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）等致病原繼發(fā)感染或混合感染[3]。當(dāng)其單獨感染時，僅出現(xiàn)亞臨床癥狀，表現(xiàn)溫和，可引起平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率降低。當(dāng)其與其他致病原繼發(fā)感染時，出現(xiàn)呼吸困難、發(fā)熱等典型臨床癥狀，增加了呼吸道疾病的嚴(yán)重性和持久性，導(dǎo)致死亡率上升，防控難度增加。該病具有感染率高、傳染性強(qiáng)的特點，一旦傳入豬群，很難徹底清除，是目前影響我國養(yǎng)豬經(jīng)濟(jì)效益的頑固性疫病之一，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。加強(qiáng)流行病學(xué)監(jiān)測和診斷技術(shù)研究對該病綜合防控措施的制定具有十分重要的現(xiàn)實意義。為全面掌握目前我國豬群中豬肺炎支原體的流行現(xiàn)狀，筆者通過查閱2000 年以來我國研究學(xué)者在病原分離鑒定、流行病學(xué)監(jiān)測、遺產(chǎn)變異分析等方面的研究資料，整理與分析出了目前我國豬支原體肺炎的感染現(xiàn)狀與流行特點，并綜述了豬肺炎支原體實驗室檢測技術(shù)研究進(jìn)展，對我國豬支原體肺炎的綜合防控具有重要的參考價值。

1 病原分離鑒定情況

對近十余年國內(nèi)豬肺炎支原體的分離鑒定情況進(jìn)行匯總分析，結(jié)果如表1 所示，可見我國豬肺炎支原體的分離鑒定成功率較低，2006—2016 年國內(nèi)研究學(xué)者共從164 份臨床病料樣品中成功分離鑒定出豬肺炎支原體9 株，病原分離鑒定成功率僅為5.49%（9/164），分析其原因可能為豬肺炎支原體對營養(yǎng)和培養(yǎng)條件要求極其苛刻，導(dǎo)致其成功分離鑒定率極低，成為當(dāng)前最難分離的支原體種類之一。同時，由表1 可見豬肺炎支原體在我國的感染范圍較廣，9 株豬肺炎支原體分離株覆蓋了由南到北的云南省、廣東省、湖南省、四川省、江蘇省、河南省、山西省、山東省、吉林省等9 個省份，呈全國性流行。

表1 豬肺炎支原體分離鑒定情況匯總

2 流行病學(xué)監(jiān)測情況

隨著我國對豬肺炎支原體感染的逐步重視，研究學(xué)者先后對不同地區(qū)的豬肺炎支原體感染情況進(jìn)行了流行病學(xué)監(jiān)測，結(jié)果如表2 所示，我國不同地區(qū)均存在不同程度的豬肺炎支原體感染，感染情況比較普遍，且在部分地區(qū)感染率較高，感染情況比較嚴(yán)峻，如2014 年廣東東莞地區(qū)的感染率高達(dá)86.92%，2016 年西藏林芝地區(qū)的感染率達(dá)72.69%。豬肺炎支原體已在我國豬群中廣泛流行，需采取積極的綜合防控措施進(jìn)行有效防制。

表2 豬肺炎支原體流行病學(xué)監(jiān)測情況匯總

3 遺傳變異分析情況

對豬肺炎支原體進(jìn)行遺傳變異分析可以從分子水平發(fā)現(xiàn)不同時間、不同地區(qū)流行株之間的差異以及遺傳和衍化規(guī)律，能夠為不同地區(qū)因地制宜的制定防控措施提供參考。廖永洪等[5]對河南省HN0613分離菌株進(jìn)行了P36 基因的PCR 擴(kuò)增、克隆及測序，并對其序列變異、遺傳進(jìn)化進(jìn)行分析，結(jié)果表明HN0613 分離菌株P(guān)36 基因序列與GenBank 中登錄的豬肺炎支原體P36 基因序列同源性均在98%以上，HN0613 分離菌株P(guān)36 基因未發(fā)生較大變異?？琢钤龅萚9]對豬肺炎支原體廣東分離株的P46 基因、P65 蛋白C 末端的基因編碼序列和P97 蛋白R1R2區(qū)域的基因編碼序列進(jìn)行遺傳變異分析，結(jié)果表明P46 基因、P65 基因、P97 基因與標(biāo)準(zhǔn)株J 株、232 株和7448 株的核苷酸序列同源性分別為98.9%～99.1%、99.2%～99.7%、86.6%～96.0%，豬肺炎支原體廣東分離株P(guān)46 基因、P65 基因片段高度保守，而P97 基因片段的變異較大。李石等[16]對新疆北疆部分地區(qū)122 份豬支原體肺炎陽性樣品進(jìn)行P36 基因序列分析，與參考菌株同源性為97.3%～100%，僅有個別堿基發(fā)生突變，未發(fā)生較大變異。以上分子流行病學(xué)調(diào)查資料表明，我國豬肺炎支原體的流行菌株未發(fā)生較大變異，常規(guī)疫苗能夠提供良好的免疫保護(hù)。

4 實驗室檢測方法

豬肺炎支原體常常與多殺性巴氏桿菌、PRRSV、PCV2、PRV、CSFV 等致病原混合感染?；旌细腥炯又亓思膊〉膰?yán)重程度，同時也增加了豬肺炎支原體的臨床診斷難度，故目前對豬肺炎支原體感染的確診主要依靠實驗室分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測技術(shù)。

4.1 PCR 方法

PCR 方法以樣品基因組DNA 為模板，借助DNA 聚合酶體外大量擴(kuò)增目的片段，具有簡便、迅速、特異、靈敏等優(yōu)點，但該方法的敏感性有限，容易漏檢。李瑩瑩等[20]根據(jù)GenBank 中豬肺炎支原體P46基因序列設(shè)計合成1 對特異性檢測引物，經(jīng)PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測豬肺炎支原體的PCR 方法，該方法檢測豬鼻支原體、豬絮狀支原體、雞毒支原體、豬胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌均為陰性，最低可檢出0.675 ng 的基因組DNA，可滿足臨床上對豬肺炎支原體的快速檢測要求。

4.2 熒光定量PCR 方法

熒光定量PCR 技術(shù)結(jié)合了常規(guī)PCR 方法靈敏、快速、特異的特點以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點，但該方法對儀器設(shè)備和技術(shù)人員操作水平要求均較高。宋建領(lǐng)等[21]根據(jù)GenBank登錄的豬肺炎支原體黏附素P97 基因序列設(shè)計1對特異性引物和1 條探針，建立了豬肺炎支原體實時熒光定量PCR 檢測方法，該方法能特異地檢測出豬肺炎支原體，檢測PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、乙型腦炎病毒（JEV）、豬細(xì)小病毒（PPV）等病原均為陰性，檢測豬肺炎支原體陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度可以達(dá)到10 拷貝，重復(fù)性檢測Ct 值變異系數(shù)在0.78%～1.16%之間。實時定量PCR 方法具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性，可用于豬肺炎支原體感染的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查，是一種值得推廣的快速診斷技術(shù)。

4.3 巢式PCR 方法

巢式PCR 是在常規(guī)PCR 結(jié)束后，以第一輪PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR 擴(kuò)增，故其敏感性更高，適合對病毒含量很低時的樣品進(jìn)行鑒定。吉瑪?shù)萚22]根據(jù)GenBank 上登錄的豬肺炎支原體基因組序列，在保守區(qū)基因內(nèi)部設(shè)計合成2 對引物，經(jīng)過PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測豬肺炎支原體的巢式PCR 方法，該方法檢測雞毒支原體、豬鼻支原體、豬胸膜肺炎放線桿菌、PCV2、PRV 均為陰性，第1 次擴(kuò)增的敏感性是10 pg，第2 次擴(kuò)增的敏感性是0.1 pg，第2 次比第1 次擴(kuò)增的敏感性高100 倍。應(yīng)用該方法檢測26 份臨床疑似豬肺炎支原體感染的病料，檢出陽性樣品15 份，隨機(jī)選取10 份陽性樣品PCR 產(chǎn)物進(jìn)行克隆與序列測定，結(jié)果顯示10 份陽性產(chǎn)物均為豬肺炎支原體。巢式PCR 方法的敏感性可與熒光定量PCR 方法相當(dāng)，但所用儀器與試劑只是普通的PCR 儀器與試劑，不需要熒光定量PCR方法要求的特殊儀器設(shè)備與試劑，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點，可以在短時間內(nèi)準(zhǔn)確快速地檢測出極低含量的豬肺炎支原體，具有良好的臨床實用價值。

4.4 LAMP 方法

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法（LAMP）是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，其特異性和敏感性可以與熒光PCR 媲美，同時其檢測周期短、操作簡便、對檢測硬件設(shè)備的要求較低，適合于野外現(xiàn)場使用。熊煒等[23]根據(jù)豬肺炎支原體基因序列設(shè)計6 對檢測引物，經(jīng)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測豬肺炎支原體的LAMP 方法，該方法在恒溫63 ℃水浴鍋中作用60 min 即可完成整個反應(yīng)過程，檢測PRRSV、PPV、PRV、PCV2、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）均為陰性?？梢暬疞AMP 檢測方法除普通離心機(jī)和水浴鍋外，幾乎不需要其他設(shè)備，其檢測的敏感性和可靠性不低于傳統(tǒng)PCR 方法，非常適合應(yīng)用于豬場等條件簡陋的基層實驗室使用。

4.5 顯色原位雜交法

顯色原位雜交法（CISH）是近年來建立的一種新的顯色反應(yīng)與原位雜交相結(jié)合定位檢測技術(shù)，可以在光學(xué)顯微鏡下原位檢測目的基因擴(kuò)增結(jié)果，目前應(yīng)用比較廣泛的非放射性標(biāo)記物主要有生物素、地高辛和熒光染料。其中，用地高辛作標(biāo)記物的探針，其敏感性與放射性核素標(biāo)記的探針相似，是一種理想的非放射性探針標(biāo)記物。王占偉等[24]利用地高辛標(biāo)記豬肺炎支原體P36 基因核酸探針和DAB/H2O2顯色系統(tǒng)，建立了檢測豬肺炎支原體的顯色原位雜交研究方法，該方法檢測豬胸膜肺炎放線桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌2 型均為陰性，應(yīng)用該方法檢測臨床樣品的檢測結(jié)果低于常規(guī)PCR 檢測結(jié)果。顯色原位雜交法敏感性和特異性較高，并且直觀，為豬肺炎支原體的致病機(jī)理和檢測定位研究提供了一種技術(shù)手段和參考方法，但其敏感性有限。

4.6 間接ELISA 方法

間接ELISA 方法主要用于檢測抗體，首先用特異性抗原包被固相載體，依次加入含待測抗體的樣品和酶標(biāo)記的第二抗體，通過底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，顏色深淺與待測抗體量成正比。沈青春等[25]選擇豬肺炎支原體P46 膜蛋白基因親水區(qū)序列進(jìn)行克隆，并將其內(nèi)3 個編碼Trp 的TGA 突變成TGG，然后再克隆到pET28a 載體中，在大腸桿菌BL21 細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)了高效表達(dá)，將大腸桿菌表達(dá)的豬肺炎支原體P46重組蛋白經(jīng)過洗滌、過柱純化后，作為間接ELISA包被抗原，通過對各參數(shù)和試劑的優(yōu)化，建立了檢測豬肺炎支原體的間接ELISA 方法，該方法與IDEXX ELISA 試劑盒的陽性符合率為84.2%，陰性符合率為91.4%，為豬肺炎支原體感染的抗體檢測提供了一種高通量、檢測快速、操作簡單的血清學(xué)快速檢測技術(shù)。

4.7 雙抗夾心ELISA 方法

雙抗夾心ELISA 是將特異性抗體結(jié)合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢血清中的相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加酶標(biāo)記抗體，與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗原含量。田瑞雨等[26]以抗豬肺炎支原體P46 蛋白單克隆抗體為包被抗體，抗P46 蛋白多克隆抗體為檢測抗體，建立了豬肺炎支原體的雙抗體夾心ELISA 方法，該方法的重復(fù)性變異系數(shù)小于10%，最低檢出量為9.754 ng/mL，檢測豬鼻支原體、豬滑液支原體、絮狀支原體等均為陰性。雙抗夾心ELISA 具有良好的重復(fù)性、敏感性和特異性，為豬肺炎支原體感染的診斷和流行病學(xué)調(diào)查等提供一種高通量、檢測快速、操作簡單的血清學(xué)方法。

4.8 膠體金免疫層析方法

膠體金免疫層析法（GICA）是結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫技術(shù)、層析技術(shù)發(fā)展起來的一種新型免疫學(xué)檢測技術(shù)，具有簡便、快速、不需儀器設(shè)備、結(jié)果判斷直觀、無污染等優(yōu)點，在動物疫病診斷尤其是基層獸醫(yī)實驗室現(xiàn)地診斷中得到了廣泛應(yīng)用。趙肖[27]通過檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，將其標(biāo)記豬肺炎支原體特異性抗原P46 蛋白作為金標(biāo)液并包被在玻璃纖維膜上，利用P46 蛋白包被檢測線，利用抗P46 蛋白單抗包被質(zhì)控線，建立了可用于豬肺炎支原體血清抗體檢測的膠體金免疫層析檢測方法。該方法檢測PRRSV、PCV2、PRV、豬鼻支原體和豬滑液支原體等病原陽性血清均為陰性，檢測豬肺炎支原體陽性血清的最大稀釋倍數(shù)為1∶32，與商品化豬肺炎支原體ELISA 抗體檢測試劑盒符合率為96.1%。膠體金免疫層析法無需特殊儀器設(shè)備、肉眼判讀，具有快速、靈敏、特異、操作簡便等特點，為現(xiàn)場檢測和快速診斷提供了新的模式，在基層獸醫(yī)單位具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

5 結(jié)語

現(xiàn)階段的感染現(xiàn)狀分析表明，豬肺炎支原體在我國豬群中呈全國性、散發(fā)性流行，其整體感染率一直居高不下，應(yīng)加強(qiáng)重視。對于豬支原體肺炎的各種實驗室診斷技術(shù)，顯色原位雜交法對試驗條件要求高、費用成本高，且敏感性有限，適合致病機(jī)理和組織定位研究，不適合基層實驗室快速診斷。LAMP 和膠體金方法檢測快速、對儀器設(shè)備要求較低，非常適合基層實驗室使用，但敏感性太高，易導(dǎo)致假陽性結(jié)果。PCR、巢式PCR、ELISA 方法操作簡單、檢測快速、高通量，是目前豬肺炎支原體臨床診斷和流行病學(xué)監(jiān)測的主要方法，且巢式PCR 方法的敏感性比PCR 方法還要高，但PCR、巢式PCR 方法需使用溴化乙錠（EB）對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，對環(huán)境和人體健康產(chǎn)生一定的威脅。熒光PCR 方法解決了PCR 方法的EB 污染問題，且能夠定量檢測，但對儀器和操作人員技術(shù)水平要求較高，適合有條件的實驗室使用。相信隨著豬肺炎支原體實驗室檢測技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，我國對豬肺炎支原體的不斷重視以及防控措施的不斷完善，豬支原體肺炎的感染也將會逐步得到控制，進(jìn)而實現(xiàn)豬肺炎支原體的區(qū)域性凈化，并最終達(dá)到全國性凈化。