銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制研究*

徐雁峰,王慧敏，張 冬

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014000；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸科)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是目前臨床上常見的革蘭陰性桿菌，是最常見的引起嚴(yán)重院內(nèi)獲得性感染的條件致病菌之一。在機(jī)體抵抗力下降或免疫功能受損或是侵入性操作時(shí)(如留置尿管、呼吸機(jī)輔助通氣)易引起各種感染，如泌尿系感染、呼吸道感染、腦膜炎、燒傷感染等，其中以下呼吸道感染最為常見，包括支氣管擴(kuò)張合并感染、慢性阻塞性肺疾病合并感染、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎等，且主要分布于重癥監(jiān)護(hù)病房。銅綠假單胞菌具有易定值，易變異，易耐藥特點(diǎn)[1]。該菌可隨著醫(yī)護(hù)人員的手接觸、醫(yī)療用水、機(jī)械通氣等直接或間接性傳播；在國外，慢性銅綠假單胞菌的定植是囊性纖維化(CF)肺病過程中的核心因素，是導(dǎo)致CF患者發(fā)病率和死亡率上升的主要原因。Zavascki等[2]進(jìn)行的研究表明，抗生素的選擇壓力和長(zhǎng)時(shí)間使用加快了細(xì)菌突變的速度。因此抗生素的濫用，使得銅綠假單胞菌基因發(fā)生突變，導(dǎo)致耐藥性在細(xì)菌間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移，使得銅綠假單胞菌耐藥現(xiàn)象逐漸突顯，出現(xiàn)多重耐藥銅綠假單胞菌(Multidrug-resistant pseudomonas aeruginosa，MDRPA)，給人們的安全帶來巨大的威脅，引起了感染相關(guān)專家對(duì)公共衛(wèi)生的關(guān)注。由其所引起的疾病具有難治愈、高致死率及遷延不愈性等特點(diǎn)，給臨床治療帶來巨大困難，嚴(yán)重威脅人類的健康。

碳青霉烯類抗生素(Carbapenem antibiotic)是抗菌譜最廣、抗菌活性最強(qiáng)的一類β-內(nèi)酰胺類抗生素，曾一度是治療銅綠假單胞菌感染的首選藥物。20世紀(jì)70年代末期，默克公司研究人員從牲畜鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)一類新的β-內(nèi)酰胺類抗生素-硫霉素，這是歷史上第一個(gè)碳青霉烯類抗生素。1987年，該公司通過對(duì)硫霉素的半合成結(jié)構(gòu)修飾，成功開發(fā)出第一個(gè)用于臨床的碳青霉烯類抗生素-亞胺培南，之后碳青霉烯類藥物開始被陸續(xù)開發(fā)并廣泛應(yīng)用于臨床各科室，目前以亞胺培南和美羅培南為代表的碳青霉烯類抗生素被臨床廣泛用于治療銅綠假單胞菌感染，尤其在重癥感染患者治療上發(fā)揮了重要作用。然而近年來，世界各地逐漸出現(xiàn)了耐碳青霉烯類抗生素銅綠假單胞菌(Carbapenem-resistant pseudomonas aeruginosa，CRPA)，2017年世界衛(wèi)生組織(WHO)制定了一份關(guān)于全球耐藥菌的排列名單，耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌與耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌，耐碳青霉烯類、第三代頭孢菌素的腸桿菌科細(xì)菌排在最前。耐碳青霉烯銅綠假單胞菌的出現(xiàn)使得臨床上對(duì)感染性疾病的治療變得愈加困難。Hong等[3]通過對(duì)50個(gè)國家臨床CRPA分離株的耐藥情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在巴西、秘魯、哥斯達(dá)黎加、俄羅斯、希臘、波蘭、伊朗和沙特阿拉伯等地銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥率均高于50 %。美國INFORM(International network for optimal resistance monitoring)監(jiān)測(cè)了2012～2015年79個(gè)美國醫(yī)療中心銅綠假單胞菌對(duì)美羅培南的耐藥率，結(jié)果顯示耐藥率從18.0 %上升到19.1 %[4]。2015年、2016年、2017年中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)CHINET結(jié)果顯示,PA對(duì)亞胺培南的耐藥率為27.6 %、28.7 %、23.6 %，對(duì)美羅培南耐藥率為23.4 %、25.3 %、20.9 %。一項(xiàng)對(duì)全球CRPA的流行病學(xué)報(bào)道顯示，南美洲、歐州和西南亞地區(qū)是CRPA的主要地區(qū)，對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥率最高可達(dá)75.3 %?？梢娿~綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素具有很高的耐藥性。

CRPA的出現(xiàn)，給臨床抗感染帶來了嚴(yán)峻的考驗(yàn)，因此研究銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制具有重要意義，本文就其耐藥機(jī)制做一綜述。

1 產(chǎn)生碳青霉烯酶

銅綠假單胞菌可產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類鈍化酶等多種酶，其中產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是PA耐藥的主要機(jī)制，此酶可以通過水解或非水解方式破壞β-內(nèi)酰胺酶的β-內(nèi)酰胺環(huán)使抗菌藥物失活而無法發(fā)揮抗菌作用。目前對(duì)于β-內(nèi)酰胺酶的分類法主要有兩類，Ambler分子結(jié)構(gòu)法是1980年Ambler提出的，根據(jù)β-內(nèi)酰胺酶氨基酸序列分為A-D類，其中A類、C類和D類β-內(nèi)酰胺酶是依賴絲氨酸發(fā)揮作用，而B類β內(nèi)酰胺酶是依賴金屬離子發(fā)揮作用，是引起銅綠假單胞菌獲得性耐藥的主要酶。另一種分類方法是Bush分類法，是Bush于1995年提出，他以酶作用的底物、抑制劑譜的不同將β-內(nèi)酰胺酶分為四個(gè)大類(1-4)及六個(gè)亞類(a-f)，主要包括超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)、金屬酶(MBLs)、頭孢菌素酶(AmpC)，OXA型內(nèi)酰胺酶等。碳青霉烯酶是一類能水解碳青霉烯類抗生素的β內(nèi)酰胺酶，主要是指Ambler法的A、B、D類。

1.1A類碳青霉烯酶 A類碳青霉烯酶包括KPC型、GES型、SME型、IMI型、SFC型等，其中以KPC型和GES型最為常見，以質(zhì)粒形式存在，造成大范圍耐藥銅綠假單胞菌的傳播。近年來對(duì)KPC型碳青霉烯酶報(bào)道較多，KPC多見于肺炎克雷伯桿菌，1996年首次在美國的一種肺炎克雷伯菌中檢測(cè)到。2006年，哥倫比亞國際醫(yī)學(xué)研究和教育中心首次報(bào)道KPC-2在假單胞菌中的存在情況，2011年浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院報(bào)道了首例產(chǎn)blaKPC-2型碳青霉烯酶的銅綠假單胞菌，之后KPC在銅綠假單胞菌的報(bào)道逐漸增多[5]。KPC酶屬于Ambler-A類，Bush-2f類，位于質(zhì)?；蛉旧w上，染色體編碼的KPC可能有利于產(chǎn)KPC銅綠假單胞菌高風(fēng)險(xiǎn)克隆的擴(kuò)散。Garcia等[6]通過比較產(chǎn)生KPC酶的肺炎克雷伯菌感染爆發(fā)之前和之后銅綠假單胞菌分離株的耐藥性，發(fā)現(xiàn)爆發(fā)后銅綠假單胞菌獲得了KPC基因，從而表明了KPC基因可在細(xì)菌間傳播導(dǎo)致銅綠假單胞菌獲得對(duì)碳青霉烯類抗生素高水平的耐藥性。目前已經(jīng)鑒定出至少23種KPC蛋白變體。

1.2產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶(metal-β-actamases，MBLs) 金屬β-內(nèi)酰胺酶(metal-β-actamases，MBLs)是以金屬離子為活性中心的酶，可以水解大部分β-內(nèi)酰胺類抗生素，且需要依賴金屬離子Zn2+發(fā)揮作用。首次發(fā)現(xiàn)是因蠟樣芽胞桿菌產(chǎn)生能被EDTA抑制的β-內(nèi)酰胺酶，之后世界各地相繼報(bào)道了能產(chǎn)生MBLs的各種細(xì)菌。編碼MBLs的基因位點(diǎn)存在于銅綠假單胞菌的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或染色體上，以基因盒存在于整合子之中,大部分位于Ⅰ類整合子,通過整合子傳遞作用,使耐藥性在革蘭陰性細(xì)菌間水平傳播擴(kuò)散，引起銅綠假單胞菌的多重耐藥(MDR)甚至泛耐藥(XDR)，進(jìn)而導(dǎo)致感染的爆發(fā)，使得臨床治療變得復(fù)雜化。MBLs可分為天然和獲得性金屬酶，獲得性MBLs主要為質(zhì)粒介導(dǎo)的，隨著質(zhì)粒的移動(dòng)將耐藥基因播散在各個(gè)菌株，是臨床上最多見的。天然MBLs為染色體編碼的，存在于一些臨床非重要致病菌中，不具有傳導(dǎo)性，沒有致病性，是細(xì)菌為適應(yīng)生存環(huán)境而產(chǎn)生的酶。獲得性MBLs是銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生獲得性耐藥的主要原因。脈沖場(chǎng)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(PFGE)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)MBLs銅綠假單胞菌在遺傳學(xué)上緊密相關(guān)，表明MBLs基因的擴(kuò)散是由耐藥菌株的克隆傳播或耐藥基因在不同菌株間傳遞引起的[7]。MBLs屬于Ambler-B類，Bush-3類，目前發(fā)現(xiàn)的獲得性金屬酶包括IMP、VIM、GIM、SPM、SIM、NDM-1、FIM-1，臨床最常見的是IMP和VIM。近年來發(fā)現(xiàn)了MBLs的亞類，進(jìn)一步說明了MBLs的持續(xù)多樣化以及這些酶在革蘭氏陰性菌種中的持續(xù)全球傳播。

IMP-1是1991年日本研究者在粘質(zhì)沙雷菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)獲得MBLs，之后不斷發(fā)現(xiàn)新的獲得MBLs，這些金屬酶的宿主也從粘質(zhì)沙雷菌擴(kuò)大到了銅綠假單胞菌等腸桿菌科細(xì)菌，而銅綠假單胞菌是主要宿主。目前已發(fā)現(xiàn)了IMP五十幾種亞型，分別由相應(yīng)編碼基因的不同位點(diǎn)發(fā)生突變產(chǎn)生。1999年意大利在銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)首個(gè)VIM-1型酶，隨后在美國、法國、英國、意大利等國家相繼發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌產(chǎn)不同亞型 VIM基因。目前已發(fā)現(xiàn)了VIM四十幾種，VIM-2是銅綠假單胞菌中分布最廣的MBL，并且是多次爆發(fā)的來源。

NDM-1是一種新型金屬酶，最初在2009年從一位感染肺炎克雷伯桿菌的瑞典患者分離發(fā)現(xiàn)，之后在銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和大腸桿菌中均有發(fā)現(xiàn)。2011年，首次在塞爾維亞患者中記錄了銅綠假單胞菌中NDM-1的存在,之后在世界各地耐藥銅綠假單胞菌均有發(fā)現(xiàn)，NDM-1可以水解大部分β內(nèi)酰胺類抗生素包括碳青霉烯類抗生素，是最廣譜耐藥的金屬酶。NDM-1位于質(zhì)粒上，不僅可以在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，而且能使所在宿主菌成為超級(jí)細(xì)菌，嚴(yán)重威脅著人類健康。FIM-1是2012年從佛羅倫薩血管移植物感染患者培養(yǎng)的多重耐藥銅綠假單胞菌中分離出一種新型金屬酶，位于染色體上，與NDM表現(xiàn)出最高的相似性(約40 %氨基酸同一性)，F(xiàn)IM-1具有廣泛的底物特異性，優(yōu)選青霉素和碳青霉烯類[8]。

KHM-1是1997年在日本的多重耐藥檸檬酸桿菌分離物中鑒定出來的，之后再未報(bào)道過。Pfennigwerth等[9]在銅綠假單胞菌分離物發(fā)現(xiàn)了新的金屬酶HMB-1，與KHM-1在核苷酸水平上的同一性為73.6 %，在氨基酸水平上的同一性為74.3 %，但在碳青霉烯酶水解方面表現(xiàn)出明顯差異，通過測(cè)定最低抑菌濃度(MIC)發(fā)現(xiàn)HMB-1對(duì)亞胺培南的水解高于KHM-1的2倍，而對(duì)美羅培南、厄他培南的水解效率非常相似。

1.3產(chǎn)OXA型酶 OXA型酶屬于Ambler D類，Bush 2d類，因?qū)Ρ竭蛭髁只蚴锹冗蛭髁值扔泻軓?qiáng)的水解能力而得名。OXA型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，是從20世紀(jì)80年代后期隨著DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展才從絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶中分離出來，并單獨(dú)成為一類。之后該酶在世界范圍內(nèi)陸續(xù)被檢測(cè)到，如法國、西班牙、英國等許多國家均檢出，近日秘魯發(fā)現(xiàn)了同時(shí)表達(dá)OXA-1的銅綠假單胞菌[10]。國內(nèi)在安徽、湖南、鄭州、蘇州、貴州等地也曾報(bào)道過OXA型酶。OXA型酶主要分布在鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌。Bert等[11]闡述了OXA型酶分5組，其中OXA-5、OXA-10、OXA-11、OXA-14、OXA-16、OXA-17、OXA-31等見于銅綠假單胞菌內(nèi)[12]。OXA-198是2011年El等[13]新發(fā)現(xiàn)的D類β內(nèi)酰胺酶，OXA-198基因位于IncP-11型質(zhì)粒攜帶的Ⅰ類整合子上，易于在銅綠假單胞菌或大腸桿菌中轉(zhuǎn)化。最近，Bonnin等[14]描述了產(chǎn)生OXA-198的銅綠假單胞菌與醫(yī)院相關(guān)的叢集事件，揭示OXA-198的產(chǎn)生使碳青霉烯類藥物敏感性降低。

2 膜通透性下降

細(xì)胞膜是藥物進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)發(fā)揮作用的第一道屏障，銅綠假單胞菌的細(xì)胞內(nèi)膜由具有流動(dòng)性的脂質(zhì)雙分子層組成，外膜包括脂蛋白、外膜蛋白和脂多糖等，脂多糖為6～7條鏈相互共價(jià)連接而成的脂肪酸鏈組成，這可降低外膜的流動(dòng)性，阻礙脂溶性藥物通過細(xì)菌外膜。碳青霉烯類抗生素進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用的靶位是位于內(nèi)膜上的青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)，需先通過外膜才能到達(dá)靶點(diǎn)，所以任何導(dǎo)致銅綠假單胞菌外膜通透性降低的因素都會(huì)導(dǎo)致抗菌藥物無法到達(dá)作用位點(diǎn)，從而使細(xì)菌對(duì)該種抗生素耐藥。

2.1膜孔蛋白的丟失 銅綠假單胞菌外膜上有許多微孔通道蛋白，如OprC、OprD2、OprE，其中外膜孔通道OprD2是以亞胺培南為代表的碳青霉烯類抗菌藥物進(jìn)入PA唯一通道。OprD2的基因突變或者缺失致使OprD2功能缺失或表達(dá)下調(diào)造成細(xì)胞外膜對(duì)抗菌藥物通透性下降，是銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南等碳青霉烯類抗生素耐藥的重要機(jī)制。OprD2的缺失突變體現(xiàn)在編碼區(qū)的一段片段缺失導(dǎo)致移碼突變，形成新的密碼子從而引起肽鏈異常，導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥。Liu等[15]通過對(duì)17株耐亞胺培南、美羅培南的銅綠假單胞菌分析顯示其中14株OprD2蛋白的基因由于移碼，無義突變或大缺失、或是缺少終止密碼子而導(dǎo)致密碼子編碼提前終止，進(jìn)一步表明OprD2的丟失使銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥性。因此認(rèn)為Oprd2是造成PA對(duì)亞胺培南耐藥的重要因素。OprD2的基因突變體現(xiàn)在OprD2結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控基因、調(diào)控因子等突變，進(jìn)而影響OprD2蛋白水平或空間構(gòu)象的改變。此外插入OprD2的序列(IS)元件也可導(dǎo)致OprD2基因失活，世界范圍內(nèi)均有報(bào)告不同的插入元件IS，南非(ISPa26)、克羅地亞(ISRP10)、伊朗(ISPa1328)、西班牙(ISPa133)、中國(ISPa1328、ISPre2)等。Shariati等[16]在OprD2蛋白基因中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的插入序列ISPpu21與銅綠假單胞菌的碳青霉烯耐藥性密切相關(guān)。

2.2主動(dòng)外排系統(tǒng)過度表達(dá) 銅綠假單胞菌細(xì)胞膜上存在著將抗菌藥物排出體外的外排泵系統(tǒng)。根據(jù)染色體的不同同源性，可將外排泵系統(tǒng)分為易化子超家族(MFS)、耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化家族(RND)、ATP結(jié)合盒超家族(ABC)、多重藥物和毒性化合物外排家族(MATE)和小多重性耐藥家族(SMR)五個(gè)超家族，其中RND外排家族與碳青霉烯抗菌藥物的耐藥有關(guān)也是最早發(fā)現(xiàn)的外排泵系統(tǒng)，主要分布在革蘭陰性菌，參與多種抗菌藥物的排出。1993年P(guān)oole等在銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)多藥外排泵MexAB-OprM，之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多個(gè)外排泵系統(tǒng)如：MexAB-oprM、MexXY-oprM、MexCD-oprJ、MexEF-OprN等。外排泵系統(tǒng)由膜融合蛋白如MexA、MexC，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如MexB、MexD和外膜蛋白如OprD、OprJ三部分組成，三種蛋白協(xié)同作用將進(jìn)入菌體內(nèi)的碳青霉烯類藥物排除體外，任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題即可導(dǎo)致多重耐藥甚至泛耐藥。Babak等[17]研究顯示62 %的個(gè)體外排泵MexAB-OprM基因過度表達(dá)，與先前報(bào)道的這些基因的過度表達(dá)超過50 %相符。MexXY-OprM系統(tǒng)和MexAB-OprM系統(tǒng)共用OprM作為其外膜通道蛋白，因此MexAB-OprM低表達(dá)也降低MexXY活性，此外MexCD-OprJ過表達(dá)可明顯使MexAB-OprM產(chǎn)生不足。外排泵系統(tǒng)具有可誘導(dǎo)性，抗生素的不規(guī)范使用可誘導(dǎo)其表達(dá)增加，曾章悅等[18-19]通過體外碳青霉素誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)對(duì)敏感銅綠假單胞菌進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌經(jīng)其誘導(dǎo)后對(duì)美羅培南的最低抑菌濃度升高，考慮銅綠假單胞菌對(duì)美羅培南的耐藥與外排泵表達(dá)量增加有關(guān)。

3 細(xì)菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)形成

1978年Costerton首先提出生物被膜這一概念，細(xì)菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)是指細(xì)菌附著于惰性物體或生物物體表面如醫(yī)療設(shè)備，留置導(dǎo)管或壞死的組織上，繁殖并分泌一些多糖基質(zhì)和纖維蛋白等細(xì)胞外聚合物，將細(xì)菌粘連包裹其中而形成的膜樣物。BF結(jié)構(gòu)堅(jiān)韌穩(wěn)固，長(zhǎng)期存在可作為細(xì)菌的保護(hù)傘使其逃避宿主免疫應(yīng)答、抵擋抗菌藥物的殺菌作用而難以根除，對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥，進(jìn)而導(dǎo)致難治性感染和慢性、持續(xù)性感染。銅綠假單胞菌生物被膜細(xì)胞外聚合物(EPS)可延緩包括抗生素的擴(kuò)散，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗生素耐受。EPS是由胞外多糖、蛋白質(zhì)、核酸組成，其中主要成分胞外多糖包括polysaccharide synthesis locus(Psl),pellicle Formation(Pel)和藻酸鹽(Alginate)，尤其是Ps1對(duì)銅綠假單胞菌中BF形成具有重要作用。Psl多糖的過量產(chǎn)生導(dǎo)致銅綠假單胞菌的細(xì)胞表面和細(xì)胞間粘附增強(qiáng)，形成微菌落，穩(wěn)固生物被膜結(jié)構(gòu)的同時(shí)對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥。研究發(fā)現(xiàn)形成生物被膜的多糖物質(zhì)Psl可作為一種信號(hào)分子通過調(diào)節(jié)鳥苷酸的產(chǎn)生形成一種正反饋，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)形成生物被膜，這對(duì)于研究銅綠假單胞菌的耐藥具有重要作用[20]。c-di-GMP信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)是導(dǎo)致生物膜形成的主要機(jī)制。藻酸鹽(Alginate)是EPS主要成分，可以形成穩(wěn)固的保護(hù)屏障阻礙抗生素穿透生物被膜，難以對(duì)包裹其中的細(xì)菌產(chǎn)生抗菌作用，導(dǎo)致感染反復(fù)發(fā)作。小RNA(sRNA)是銅綠假單胞菌生物被膜形成的重要機(jī)制。Taylor等[21]描述了一個(gè)新的非編碼小RNA(sRNA)轉(zhuǎn)錄物srbA對(duì)生物膜的形成和毒力有重要影響。

4 整合子(integron)的形成

整合子是存在于細(xì)菌質(zhì)粒、染色體或轉(zhuǎn)座子上的一種具有識(shí)別和捕獲各種耐藥基因并通過移動(dòng)，將耐藥基因傳播在同種和不同種細(xì)菌間，最終導(dǎo)致臨床上耐藥現(xiàn)象的泛濫。整合子是Stokes和Hall于1989年首次提出的，由兩端的保守區(qū)和中間的可變區(qū)構(gòu)成,可變區(qū)中含有多種基因盒，大部分為耐藥基因盒，在5′端保守段包含有編碼整合酶的intI基因和負(fù)責(zé)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，當(dāng)整合子捕獲到耐藥基因盒后，在啟動(dòng)子的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)錄從而使細(xì)菌獲得耐藥性。整合子根據(jù)其整合酶編碼基因序列的不同可分為6類，其中Ⅰ類整合子最為常見且與銅綠假單胞菌耐藥密切相關(guān)。目前在Ⅰ類整合子可變區(qū)中發(fā)現(xiàn)多種耐藥基因盒，如VIM、IMP、SHV等，這些耐藥基因使銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生高耐藥水平。Khosravi等[22]通過研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌耐藥性與整合子密切相關(guān)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)(95.7 %)分離株包含Ⅰ類整合子且對(duì)美羅培南耐藥性可達(dá)到(90.32 %)，對(duì)亞胺培南的耐藥率達(dá)(83.87 %)。

總之，銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥現(xiàn)象是多種耐藥機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果，并不單純是由一種因素造成。CRPA的出現(xiàn)，給臨床治療造成了巨大的壓力，這需要我們進(jìn)一步深入研究其耐藥及流行機(jī)制，為指導(dǎo)抗生素的合理使用及開發(fā)新的有效抗菌藥物提供理論依據(jù)。近年來，多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)被廣泛用于記錄細(xì)菌基因的變異，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)耐藥菌株的追蹤,對(duì)研究銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制具有重要意義。多位點(diǎn)序列分型是Maiden等人在1998年提出的用于分析基因的核苷酸序列，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)細(xì)菌基因的變異。MLST通過使用管家基因中的序列變異來定義類型，以ST編號(hào)為基本分析單位，每一個(gè)ST標(biāo)號(hào)代表一種核苷酸序列信息，目前應(yīng)用于耐藥菌株的追蹤。通過對(duì)銅綠假單胞菌的7個(gè)管家基因(acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE)進(jìn)行PCR擴(kuò)增純化，產(chǎn)物測(cè)序后與BLAST對(duì)比得出七個(gè)管家基因等位基因譜編號(hào)，依據(jù)編號(hào)的組合即能夠得到ST型，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)全球銅綠假單胞菌的流行趨勢(shì)及毒力進(jìn)化變異的追蹤調(diào)查。在銅綠假單胞菌中，MBLs的產(chǎn)生通常與序列類型(STs)111、175、357和235的多耐藥高風(fēng)險(xiǎn)克隆相關(guān)，表明高風(fēng)險(xiǎn)克隆在成功傳播臨床重要抗藥性決定因素中的重要作用。Papagiannitsis等[23]發(fā)現(xiàn)捷克醫(yī)院中攜帶IMP-7的銅綠假單胞菌中ST357克隆編碼整合子In-p110，證明大多數(shù)ST357分離株與IMP型MBLs的產(chǎn)生相關(guān)。Vanegas等[24]研究表明高抗生素選擇壓力有利于多克隆的出現(xiàn)，這些克隆能夠分別含有KPC和VIM碳青霉烯酶，主要是ST235和ST111，但同時(shí)出現(xiàn)其他克隆如ST1755、ST463。序列類型235(ST235)是重要的銅綠假單胞菌克隆，銅綠假單胞菌ST235可以通過突變和獲得當(dāng)?shù)啬退幓?，?duì)碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥性[25]。在ST235中已經(jīng)描述了多種碳青霉烯酶，最常見的是VIM，其次是IMP，OXA，GES，KPC和NDM。目前發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒編碼的產(chǎn)NDM-1的銅綠假單胞菌MLST分型有ST235，染色體編碼的KPC基因可能有利于產(chǎn)生KPC的銅綠假單胞菌ST235擴(kuò)增時(shí)的傳播。Hu等[26]首次報(bào)道了產(chǎn)生KPC-2的ST463銅綠假單胞菌分離株的克隆，該克隆在浙江省快速出現(xiàn)和傳播。