逆流浸泡玉米漿中微生物的變化及其作用研究

金渭武 焦琳 沈雪梅 陳博 李義 陶進(jìn) 佟毅

摘 ?????要： 逆流浸泡工藝已被廣泛應(yīng)用于玉米濕法淀粉生產(chǎn)中。玉米逆流浸泡中微生物會(huì)不斷生長(zhǎng)、繁殖，代謝并產(chǎn)生活性物質(zhì)作用于玉米籽粒，提高浸泡效果。但目前對(duì)玉米浸泡過(guò)程中微生物的變化規(guī)律及其作用研究不多。采集了中糧生化龍江工廠中兩批6個(gè)不同時(shí)間段的玉米浸泡液（2、10、18、26、33和41 h）共12個(gè)樣品，測(cè)定其有機(jī)酸組成、pH和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，浸泡液中的有機(jī)酸含量和pH都隨著浸泡時(shí)間逐漸降低，乳酸含量從30 g/L左右（2 h）降低到<10 g/L（41 h），pH維持在4.0±0.2。整個(gè)浸泡過(guò)程中，乳酸桿菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)并在浸泡前期發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，從2到41 h占比分別為95.8%，89.6%，76.1%，77.9%，52.2%和 58.4%。芽孢桿菌屬豐度從浸泡10 h開始上升并成為第二優(yōu)勢(shì)菌。

關(guān) ?鍵 ?詞：逆流浸泡;乳酸;乳酸菌;微生物群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：TQ 033 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ??????文章編號(hào)： 1671-0460（2019）06-1228-04

Abstract： The countercurrent steeping of corn has been widely used in the production of starch. During the corn soaking， lactic acid bacteria fermentation broth was added to increase the soaking effect of corn and reduce the use of sulphur. In this paper， 12 samples of 6 batches of corn soaking liquid （2， 10， 18， 26， 33 and 41 h） were collected from COFCO biochemical Longjiang factory. The organic acid composition， pH and bacterial composition were determined. Both the concentration of organic acid and the pH gradually decreased with time. The lactic acid concentration decreased from about 30 g/L （2 h） to <10 g/L （41 h）， and the pH maintained at 4.0 ± 0.2. During the whole soaking process， Lactobacillus was dominant， accounting for 95.8%， 89.6%， 76.1%， 77.9%， 52.2% and 58.4%， respectively， from 2 h to 41 h. The abundance of Bacillus increased from 10 h as the second dominant bacteria.

Key words： Countercurrent steeping; Lactic acid; Lactic acid bacteria; Microbial community

玉米淀粉生產(chǎn)工藝主要分為干法工藝和濕法工藝兩種，干法工藝較濕法工藝所得產(chǎn)品中蛋白質(zhì)、脂肪含量高，淀粉純度低，因此目前淀粉生產(chǎn)主要采用濕法工藝。而濕法玉米淀粉生產(chǎn)工藝因?yàn)榻莘绞讲煌址譃殪o止浸泡法和逆流浸泡法。相對(duì)于靜止浸泡法，逆流浸泡法使玉米與浸泡液中可溶性物質(zhì)始終保持較大的濃度差以利于玉米中可溶性物質(zhì)向浸泡液中轉(zhuǎn)移，從而能更好地降低浸泡玉米中的可溶性物質(zhì)含量，便于在洗滌時(shí)徹底除去殘余的可溶性物質(zhì)，提高淀粉純度。因此，逆流浸泡法被濕法玉米淀粉生產(chǎn)工廠廣泛采用[1]。

許多研究表明，在玉米浸泡液中添加乳酸可顯著縮短玉米淀粉生產(chǎn)的浸泡時(shí)間，降低亞硫酸的使用濃度[2，3]。而玉米浸泡過(guò)程不僅僅是物理擴(kuò)散過(guò)程，也是生物化學(xué)變化的過(guò)程。在浸泡工藝條件下，溫度、酸度等都非常適合微生物尤其是乳酸菌的生長(zhǎng)。因此，浸泡過(guò)程也是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的過(guò)程，這也是玉米浸泡中沒有外加乳酸而浸泡液中會(huì)含有較高乳酸的原因。另外研究也表明外接一定比例的乳酸菌發(fā)酵液可以大大縮短玉米浸泡的時(shí)間，提高玉米浸泡液的質(zhì)量[4，5]?；谌樗峋l(fā)酵產(chǎn)生乳酸提高玉米浸泡效果，降低二氧化硫的使用量。在濕法玉米淀粉生產(chǎn)中，趙壽經(jīng)等采用從玉米浸泡液中分離的一株嗜熱乳酸菌C15，通過(guò)發(fā)酵罐培養(yǎng)后再接種到玉米浸泡液中，使噸玉米淀粉產(chǎn)出的硫磺用量大幅降低[4]。同時(shí)玉米浸泡也是微生物生長(zhǎng)、繁殖，新陳代謝產(chǎn)生各種活性物質(zhì)并作用于玉米籽粒的過(guò)程。但迄今為止，玉米浸泡過(guò)程中微生物的群落變化并沒有被系統(tǒng)地研究過(guò)。本文通過(guò)對(duì)中糧生化工廠玉米濕法淀粉生產(chǎn)中，不同時(shí)間段的玉米逆流浸泡液進(jìn)行采樣，測(cè)定其有機(jī)酸組成、pH 值及其微生物組成，系統(tǒng)分析玉米浸泡中微生物群落結(jié)構(gòu)變化，探討其在玉米浸泡中的作用。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?實(shí)驗(yàn)材料

玉米浸泡液分別取自中糧生化龍江公司玉米浸泡車間2#罐和7#罐，兩罐時(shí)間間隔為2 d。準(zhǔn)備50 mL滅菌離心管12個(gè)，待玉米入罐后，在同一浸泡罐中分別于 2、10、18、26、33和41 h 取玉米漿1管（50 mL/管），取樣后迅速冷凍保存，以備提取細(xì)菌基因組和各種指標(biāo)測(cè)定。

1.2 ?儀器設(shè)備

儀器：安捷倫1260，色譜柱：Bio-RadAminex

HPX-87HColumn（300 mm×7.8 mm 8 μm），BioTeke自動(dòng)核酸提取儀（百泰克，北京），NanoDrop 2000C（美國(guó)Thermo），Eppendorf 離心機(jī)。

1.3 ?實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ?玉米浸泡液有機(jī)酸測(cè)定

玉米浸泡液中有機(jī)酸的測(cè)定參照賈錚等[6]液相方法略作修改，以5 mM 硫酸溶液為流動(dòng)相，流速0.50 mL/min，柱溫55 ℃，DAD檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，以保留時(shí)間結(jié)合待測(cè)物質(zhì)的紫外特征吸收光譜進(jìn)行定性分析，結(jié)合外標(biāo)法進(jìn)行定量。液相樣品制作如下：待玉米浸泡液完全解凍搖勻，取100 μL漿液加入2.4 mL雙蒸水稀釋25倍，13 000 r/min離心3 min取上清，過(guò)水系液相膜放入液相瓶中，標(biāo)記好樣品名稱，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 ?細(xì)菌基因組提取

取10 mL 玉米浸泡液12 000 r/min離心5 min，棄上清，使用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒（北京BioTeke）在AU1001-96核酸提取儀（北京BioTeke）上進(jìn)行樣品的DNA提取。提取的DNA利用1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測(cè)，使用2000C NanoDrop（美國(guó)Thermo）檢測(cè)濃度。利用干冰將濃度合格的樣品（濃度≥50 ng/μL，體積>30 μL）寄送上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA 的V3-V4區(qū)域擴(kuò)增、測(cè)序及數(shù)據(jù)分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?玉米浸泡液中的有機(jī)酸及pH變化

兩批樣品的液相結(jié)果都顯示逆流浸泡液中的有機(jī)酸含量隨浸泡時(shí)間的增加而逐漸降低，乳酸濃度從2 h 的將近30 g/L逐漸變?yōu)?1 h的不到10 g/L。前18 h玉米漿中乳酸含量維持在較高水平（>15 g/L），浸泡到26 h，玉米漿中的乳酸含量也還大于10 g/L（見表1）。浸泡液中乳酸含量大幅降低主要發(fā)生在2～10 h，而33～41 h乳酸含量降低不明顯。另外隨著浸泡時(shí)間的增加，浸泡液的pH進(jìn)一步下降，但在整個(gè)浸泡過(guò)程中維持窄幅變動(dòng)（4.0 ±0.2）。

玉米逆流浸泡過(guò)程中玉米始終留在罐內(nèi)，用泵將浸泡液在罐內(nèi)一邊自身循環(huán)一邊向前一級(jí)罐內(nèi)輸送，始終保持新的亞硫酸溶液與浸泡時(shí)間最長(zhǎng)（即將結(jié)束浸泡）的玉米接觸，而新入罐的玉米與即將排出的浸泡液接觸，從而保持最佳的浸泡效果。因此，隨著時(shí)間的增加，浸泡液中的SO2會(huì)不斷升高，盡管有機(jī)酸含量降低，但浸泡液的pH值還會(huì)逐漸降低。另外，在逆流浸泡中，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，浸泡液中的糖類、氨基酸等有機(jī)浸出物越來(lái)越少，浸泡液作為細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)越來(lái)越貧瘠，不利于微生物的生長(zhǎng)繁殖，發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸少。同時(shí)由于浸泡液中SO2濃度的提高，也會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)?；趦烧忒B加作用，在浸泡后期，乳酸的含量保持在相對(duì)較低的水平。

2.2 ?浸泡過(guò)程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

2.2.1 ?門水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

在整個(gè)浸泡過(guò)程中厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，且厚壁菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（始終>73.3%）。隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，硬壁菌門豐度逐漸降低，變形菌門豐度逐漸增加，從2 h時(shí)的3.8%增加到41 h時(shí)的24% 。同時(shí)，放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度也隨浸泡時(shí)間的增加而上升。當(dāng)浸泡時(shí)間為33 h時(shí)，放線菌門豐度達(dá)到最高，約為2.0%（見圖1）。

2.2.2 ?屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

從屬的水平看，整個(gè)浸泡過(guò)程中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和鏈球菌屬（Streptococcus）為優(yōu)勢(shì)菌，其中乳酸桿菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（從2 h到41 h分別占比為95.8%， 89.6%， 76.1%，77.9%， 52.2% 和 58.4%）。浸泡10 h后，芽孢桿菌屬細(xì)菌豐度開始增加（占1.5%），18 h后基本穩(wěn)定在9.5%左右，33 h后豐度維持在12.0%左右。當(dāng)浸泡33h時(shí)，物種多樣性明顯較高，鏈球菌屬、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）和腸球菌屬（Enterococcus）的豐度均達(dá)到較高豐度，而后降低（見圖2）。

2.2.3 ?細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與有機(jī)酸含量相關(guān)性

隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，浸泡液逐漸從老酸液更換為新酸液，乳酸含量也不斷下降（表1），而乳酸桿菌占比與乳酸含量呈強(qiáng)正相關(guān)（R2=0.86）。這表明在浸泡過(guò)程中乳酸桿菌發(fā)育較好，并發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，這也是連續(xù)浸泡過(guò)程中，未添加外源乳酸，當(dāng)浸泡液在逐漸變老時(shí)（逆向，從41到2 h）乳酸含量大量增加的原因。同時(shí)，反觀41到2 h，浸泡液中的SO2濃度的逐漸降低，這有利于乳酸桿菌發(fā)酵，而乳酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸并不斷積累，抑制了其它細(xì)菌的生長(zhǎng)。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與有機(jī)酸含量相關(guān)性顯示（圖3），乳酸桿菌屬細(xì)菌豐度與系統(tǒng)中大多數(shù)其他細(xì)菌豐度呈負(fù)相關(guān)，特別是芽孢桿菌屬屬細(xì)菌豐度，且兩者對(duì)其他菌的豐度影響正好相反。

此外，乳酸含量從41～33 h變化不明顯，表明這個(gè)階段乳酸桿菌的生長(zhǎng)受到抑制，從33～10 h，乳酸含量逐漸變大，表明乳酸桿菌處于生長(zhǎng)旺盛并大量產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，而10～2 h，乳酸含量大幅度上升，表明此階段是乳酸桿菌大量產(chǎn)生乳酸時(shí)期（見圖4）。

2.2.4 ?浸泡時(shí)間與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系

根據(jù)各樣品中細(xì)菌物種組成和豐度，在屬水平（豐度前50的屬）作聚類分析熱圖（圖5），該12個(gè)樣品6個(gè)時(shí)間大致可分為三組：即浸泡2和10 h時(shí)的L7.2，L2.2，L2.10和L7.10為第一組，18 h和26 h的 L2.18，L7.18，L.26和 L7.26為第二組， 33h和41 h的L2.33，L7.41，L2.41和L7.33為第三組。這與PCA作圖的結(jié)果相似（圖6），表明物種多樣性隨浸泡時(shí)間發(fā)生變化，并在一段時(shí)間內(nèi)相對(duì)保持穩(wěn)定。

3 ?結(jié) 論

玉米浸泡過(guò)程是微生物生長(zhǎng)、繁殖，代謝并產(chǎn)生活性物質(zhì)作用于玉米籽粒的生物化學(xué)變化過(guò)程。采用逆流浸泡工藝，前期浸泡液中的SO2濃度比較低，利于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸。同時(shí)乳酸作用于玉米胚乳細(xì)胞壁，使其形成一系列的洞或坑，便于浸泡水的進(jìn)入并促進(jìn)可溶物溶出。因此，浸泡前期（2～18 h），浸泡液的營(yíng)養(yǎng)也比較豐富，乳酸桿菌生長(zhǎng)旺盛，豐度高，發(fā)酵產(chǎn)生乳酸多。

隨著浸泡時(shí)間延長(zhǎng)，SO2濃度升高，乳酸桿菌生長(zhǎng)受到抑制，芽孢桿菌屬豐度增加，表明芽孢桿菌屬更耐SO2。因此，在玉米浸泡24 h時(shí)，外加一定比例產(chǎn)乳酸的芽孢桿菌C15，該菌屬芽孢桿菌屬，可發(fā)酵產(chǎn)乳酸，從而促使玉米浸泡后期繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。因此推測(cè)，這可能是33～41 h期間，浸泡液中乳酸含量維持一定濃度的原因。乳酸的形成，加速玉米中蛋白質(zhì)的膨脹和軟化，同時(shí)又維持了浸泡液中的Ca2+、Mg2+等金屬離子的濃度，促進(jìn)SO2與玉米蛋白的結(jié)合，從而減少了硫磺的使用。此外，研究表明，許多芽孢桿菌還會(huì)分泌一些蛋白酶[7]，這有利于降解玉米中的蛋白質(zhì)，從而便于淀粉釋出。

通過(guò)本文系統(tǒng)研究逆流浸泡過(guò)程玉米漿中微生物群落結(jié)構(gòu)及其體系中有機(jī)酸和pH變化，全面了解工藝微生物與微生物間、微生物與化合物間相互作用，為玉米浸泡機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為工藝改進(jìn)與優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。

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