雞滑液囊支原體滅活疫苗的制備及其免疫保護(hù)效果研究

姜肖軍,郭亞男,何生虎

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

雞滑液囊支原體病是雞滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae,Ms)引起的一種以滲出性滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎為主的一種急性或慢性傳染病,常發(fā)于1～4月齡雞群,主要危害蛋雞和肉雞,導(dǎo)致產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)下降、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和胴體降級(jí)[1],Ms常常會(huì)結(jié)合其他致病因子使雞病情惡化,死亡率增加。Ms主要通過接觸進(jìn)行傳播,一旦感染終身帶菌,對(duì)于蛋雞養(yǎng)殖來說,垂直傳播是Ms流行、無法凈化的一個(gè)重要原因。若雛雞群中有經(jīng)垂直傳播的帶菌雛雞,該病可在短時(shí)間內(nèi)蔓延至整個(gè)雞群,發(fā)病率高達(dá)90%～100%。流行病學(xué)調(diào)查顯示,Ms在全球不同地區(qū)蛋雞群中的感染率非常高,蛋用種雞場(chǎng)的陽性率可達(dá)70 %,該病的發(fā)病率近些年在中國呈逐年上升趨勢(shì)。目前對(duì)于該病尚無有效的治療手段,藥物治療雖然能取得一定效果,但無法徹底根除Ms[2]。加上近些年抗生素殘留和耐藥性問題的不斷加重,使藥物治療在生產(chǎn)中的使用越來越受到限制,所以,研制有效的疫苗成為該病防治的一個(gè)重要突破口。目前國內(nèi)尚無針對(duì)該病的有效疫苗上市,只有澳大利亞有經(jīng)突變選育的一種弱毒苗[3],該疫苗是活苗,免疫后雖不會(huì)引起雞體發(fā)病,但會(huì)永久性的根植于雞體內(nèi),這明顯不利于養(yǎng)殖場(chǎng)的支原體清除計(jì)劃,因此在有些國家該疫苗被禁用。本研究利用Ms菌株Q5-2經(jīng)滅活處理制成Ms滅活疫苗并對(duì)該疫苗進(jìn)行安全性和不同劑量下免疫后的效果評(píng)價(jià),以期為該病滅活疫苗的研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

MsQ5-2菌株由寧夏大學(xué)臨床獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室分離并保存;20日齡海藍(lán)褐雛雞 50只(無Ms感染),由寧夏某禽業(yè)有限公司提供。Marcol-52白油佐劑購自南京天邦生物科技有限公司;雞滑液囊支原體抗體檢測(cè)試劑盒(編號(hào)為CK118)購自北京愛德士元亨生物科技有限公司;改良Frey氏培養(yǎng)基購自北京中海生物科技有限公司;普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基均購自青島海博生物科技有限公司。

1.2 Ms滅活疫苗的制備

將本實(shí)驗(yàn)室保存Ms Q5-2菌株復(fù)蘇后進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng),期間用顏色單位變化法(CCU)測(cè)定菌體濃度,待菌體濃度達(dá)到109CCU以上時(shí)在菌液中加入終濃度為0.4%的甲醛,于恒溫培養(yǎng)箱中滅活72 h。離心后,用PBS洗滌3次后重懸為原體積的1/10即得Ms抗原懸液,用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其蛋白含量,然后加入等體積白油佐劑用超聲波破碎儀使其完全乳化,制成油包水型油乳疫苗。保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3 滅活疫苗質(zhì)量檢測(cè)

將1.2中得到的抗原懸液接種于改良Frey氏固體培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基中,分別于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～7 d,根據(jù)其生長(zhǎng)情況來鑒定其滅活效果以及是否含有活菌;選取健康小鼠10只、蛋雞5只,將疫苗以肌肉注射的方式注射于動(dòng)物體內(nèi),小鼠0.2 mL/只,蛋雞0.1 mL/只,觀察1周并記錄其健康狀況。

1.4 蛋雞的分組與免疫

選取Ms抗體檢測(cè)結(jié)果為陰性的蛋雞40只,隨機(jī)分為4組,每組10只,分別為低劑量組(P1)、中劑量組(P2)、高劑量組(P3)和陰性對(duì)照組(P0),對(duì)照組單獨(dú)飼養(yǎng)。預(yù)飼1周后進(jìn)行基礎(chǔ)免疫,經(jīng)胸腹部肌肉注射,劑量為P1組0.05 mg/只;P2組0.10 mg/只;P3組0.15 mg/只;P0組注射0.50 mL生理鹽水。加強(qiáng)免疫時(shí)間分別在首免后第4周和第6周進(jìn)行,注射劑量與首免相同。

1.5 抗體水平的檢測(cè)

基礎(chǔ)免疫前1周開始,每周固定時(shí)間采血1次并分離血清,編號(hào)并保存于-20 ℃冰箱中備用。按照Ms抗體檢測(cè)試劑盒說明書對(duì)血清進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 疫苗保護(hù)效力試驗(yàn)

三免后第8周所有試驗(yàn)動(dòng)物均用MsQ5-2強(qiáng)毒(109CCU /mL )攻擊,每只雞滴鼻500 μL,滴眼200 μL,連續(xù)攻毒3 d。攻毒后連續(xù)15 d觀察雞的臨床癥狀并記錄直腸溫度,判斷是否發(fā)病的標(biāo)準(zhǔn)為:抗體檢測(cè)為陽性、病雞出現(xiàn)跛行的同時(shí)伴有雞冠蒼白、排綠色稀便及羅音3個(gè)癥狀中的任何一個(gè)癥狀即可判斷為發(fā)病。計(jì)算每組雞攻毒后的保護(hù)率。并分別于第0、5、10、15天采集咽拭子進(jìn)行Ms分離培養(yǎng)試驗(yàn)[4]。保護(hù)率=(P0組發(fā)病數(shù)-該組發(fā)病數(shù))/P0發(fā)病數(shù)×100%)

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel (Microsoft Office 2010)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì),各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,組間的差異比較采用方差分析,數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 20.0軟件,P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅活疫苗質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè),所得抗原濃度為0.8 mg/mL,加入等體積的白油佐劑后,滅活疫苗最終濃度為0.4 mg/mL。將抗原懸浮液接種于改良Frey氏培養(yǎng)基中,于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d,未見有“煎蛋樣”菌落出現(xiàn),說明滅活完全。將抗原懸浮液接種至普通瓊脂培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)2～4 d,未見有雜菌生長(zhǎng)。注射疫苗后,小鼠及蛋雞,采食正常,精神狀況良好;注射部位未見有紅腫、化膿現(xiàn)象出現(xiàn)。檢驗(yàn)結(jié)果均符合疫苗制作要求,表明疫苗安全可靠。

2.2 抗體水平的檢測(cè)

首免后收集的血清經(jīng)Ms抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示,首免1周后即可檢測(cè)到抗體的產(chǎn)生,試驗(yàn)組中3個(gè)劑量組血清抗體轉(zhuǎn)陽率為100%,對(duì)照組試驗(yàn)期間抗體一直為陰性。在第2次加強(qiáng)免疫前,3個(gè)劑量組抗體效價(jià)的變化趨勢(shì)基本一致;第2次加強(qiáng)免疫后P1組抗體效價(jià)持續(xù)上升并于首免后第12周時(shí)達(dá)到峰值1∶158 000,之后抗體效價(jià)開始緩慢下降。P2組和P3組在第2次加強(qiáng)免疫后,抗體效價(jià)經(jīng)過短暫的上升在首免后第8周時(shí)達(dá)到峰值,分別為1∶10 200和1∶6 400。達(dá)到峰值后開始下降,高劑量組的下降快于低、中劑量組(P<0.05)(圖1)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,首免8周后不同劑量組之間差異顯著(P<0.05)。說明低劑量組的免疫效果最好。

2.3 滅活疫苗免疫保護(hù)效果

采用滴鼻、滴眼方式對(duì)免疫后的試驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行攻毒,觀察其健康發(fā)病情況并計(jì)算保護(hù)率,分別于攻毒后第0、5、10、15天采集咽拭子進(jìn)行Ms分離培養(yǎng)試驗(yàn),并記錄每天15:00的肛溫。結(jié)果顯示,攻毒后對(duì)照組體溫迅速上升,然后維持在43 ℃左右,并表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀,發(fā)病率為100%;試驗(yàn)組中3個(gè)劑量組攻毒后體溫也迅速上升,但比對(duì)照組略低,第9天后體溫迅速下降并趨于正常體溫(見圖2)。低劑量組發(fā)病率為0,攻毒保護(hù)率為100%;中劑量組和低劑量組發(fā)病率為20%,攻毒保護(hù)率為80%。隨著時(shí)間的推移,免疫后的3個(gè)劑量組攻毒后排毒動(dòng)物的數(shù)量明顯少于對(duì)照組(表1)。表明經(jīng)該疫苗免疫后,蛋雞對(duì)于強(qiáng)毒攻擊具有良好的抵抗力,并對(duì)感染動(dòng)物的排毒起到了一定抑制作用。

表1 Ms滅活疫苗免疫保護(hù)效果 Table 1 Protective efficacy of the inactivated Ms vaccine

圖2 攻毒后體溫變化趨勢(shì)Fig.2 Trend of tempreture after challenge

3 討 論

目前,國內(nèi)尚無針對(duì)Ms的有效疫苗,僅有澳大利亞有經(jīng)突變選育的兩株減毒苗Ms1和(ts+)Ms-H。

該疫苗的免疫效果和保護(hù)力均已得到相關(guān)研究的證實(shí)。但是由于是活苗且價(jià)格昂貴,目前在中國還沒有得到廣泛的推廣和應(yīng)用。大部分養(yǎng)殖企業(yè)對(duì)Ms的防治依然以藥物治療為主,因此研制一種安全有效的滅活疫苗,控制中國Ms感染流行的現(xiàn)狀顯得尤為重要。

本研究成功制備了Ms滅活疫苗,為了評(píng)價(jià)該疫苗的保護(hù)效果并探究其最佳免疫劑量,分3個(gè)劑量組對(duì)蛋雞進(jìn)行免疫后,進(jìn)行了攻毒試驗(yàn)。結(jié)果證明該疫苗能刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答,并對(duì)強(qiáng)毒感染雞只的排毒具有一定的抑制作用,綜合評(píng)價(jià)后確定最佳免疫劑量為0.05 mg/只。機(jī)體的免疫應(yīng)答至少受3個(gè)因素的影響:抗原、免疫佐劑和試驗(yàn)雞本身情況,抗原劑量能明顯影響免疫應(yīng)答,抗體的濃度和抗體的效價(jià)水平,一般而言,在一定劑量范圍內(nèi),免疫效果會(huì)隨著抗原劑量的增加而增加,但過高的免疫劑量會(huì)引起機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制[5-7]。相關(guān)研究結(jié)果表明,使用0.1 mg的鼠IgG為免疫原免疫試驗(yàn)雞的免疫效果要比1 mg劑量好。目前得到大多數(shù)學(xué)者公認(rèn)的是,抗原劑量在10～1 000 μg免疫效果最佳[8],筆者所選用的劑量也以此為基礎(chǔ)。針對(duì)多次免疫中的最佳免疫間隔時(shí)間問題,存在著不同的見解和習(xí)慣,但大量研究表明為了獲得高濃度抗體,第1次和第2次抗原注射的時(shí)間間隔至少為4周,以便有足夠的時(shí)間產(chǎn)生免疫記憶[9]。故本研究中首免和二次免疫的時(shí)間間隔為4周。結(jié)果表明,3個(gè)劑量組經(jīng)過3次免疫均達(dá)到了較高的抗體效價(jià),說明滅活疫苗的免疫效果較好,與低劑量組相比,中劑量組和高劑量組在第2次加強(qiáng)免疫后抗體效價(jià)經(jīng)過短暫上升后即開始顯著下降。而低劑量組二次加強(qiáng)免疫后抗體效價(jià)持續(xù)上升,峰值達(dá)到的最高抗體效價(jià)為1∶158 000,高水平的抗體效價(jià)穩(wěn)定持久。造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于,第1次和第2次加強(qiáng)免疫時(shí)間間隔較短,這時(shí)雞體內(nèi)抗體仍處于較高的水平,再次接種劑量較大的同種抗原時(shí),雞體內(nèi)大部分抗體與抗原發(fā)生中和反應(yīng),導(dǎo)致抗體水平的上升不太顯著。疫苗保護(hù)效力試驗(yàn)表明,該疫苗對(duì)于強(qiáng)毒攻擊具有良好的保護(hù)作用,其中低劑量組的保護(hù)率最高,為100%,高劑量組為80%,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)攻毒后疫苗接種組從咽拭子中分離出支原體的概率明顯低于對(duì)照組。這一結(jié)果的不同可能是由于攻毒時(shí)3個(gè)劑量組Ms抗體水平的不同引起的,攻毒是在第3次免疫后第8周進(jìn)行的,此時(shí)P2和P3組的抗體水平已經(jīng)明顯下降,故對(duì)Ms的攻擊只能部分保護(hù)。另外Ms一經(jīng)感染終身攜帶,但不一定會(huì)發(fā)病,試驗(yàn)表明,感染1～4周齡的雞接觸健康雞后數(shù)日,健康雞的呼吸道中就能檢測(cè)到Ms的存在,所以從鼻拭子中分離出Ms并不能表明疫苗不具有保護(hù)力。

4 結(jié) 論

Ms滅活疫苗對(duì)雞具有較好的保護(hù)效果,免疫劑量會(huì)影響免疫應(yīng)答,本研究得出的最佳免疫劑量為每只雞0.05 mg。