HPLC法測定不同花色木本曼陀羅中莨菪堿和東莨菪堿含量

劉國宇，崔新愛，李艷，趙繼香，王瑋，周軍輝

(1.陜西省西安植物園，陜西 西安 710061；2.陜西省植物資源保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710061)

木本曼陀羅(BrugmansiaArborea)為茄科木本曼陀羅屬常綠灌木或小喬木，常見有黃花、紅花和白花3種花色。木本曼陀羅中含有莨菪堿(hyoscyamine)和東莨菪堿(scopolamine)等托品烷類生物堿，在臨床上主要用于治療暈動癥、胃腸痙攣性絞痛、帕金森癥、戒除藥物成癮性等[1-2]。其中，東莨菪堿藥效強(qiáng)，毒副作用較低，市場需求量大。目前，東莨菪堿的提取原料主要是洋金花[3]。有文獻(xiàn)表明木本曼陀羅是少有的東莨菪堿優(yōu)勢資源植物[4-5]。本研究采用高效液相色譜(HPLC)法對3種花色木本曼陀羅各部位中莨菪堿和東莨菪堿含量進(jìn)行測定，以期對尋找東莨菪堿優(yōu)勢資源植物提供參考。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

木本曼陀羅，采自陜西省西安植物園，采集時間為2017年12月4日，經(jīng)陜西省西安植物園李艷研究員鑒定為木本曼陀羅BrugmansiaArborea；莨菪堿對照品(批號KA0802CB14，含量≥98%)，購自上海源葉生物科技有限公司；東莨菪堿對照品(批號17121229，含量≥98%)，購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純；氨水、乙醇、乙醚、硫酸、氯仿、氫氧化鈉、磷酸鈉、十二烷基硫酸鈉、磷酸均為分析純；水為實驗室自制的超純水。

Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀(配備LC-20AT雙泵、SPD-M20A二極管陣列檢測器、SIL-20A自動進(jìn)樣器、LabSolution工作站等，InertSustain C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱)；BT125D型電子天平；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器；RV10基本型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；101A-2E電熱鼓風(fēng)干燥箱；UPH-Ⅱ-10T型超純水機(jī)。

1.2 原料預(yù)處理

采集時，將木本曼陀羅的根、莖、葉、花等不同部位分開采集，陰干后置于50 ℃恒溫烘箱內(nèi)繼續(xù)烘干，粉碎并過40目篩，密封保存，備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 對照品儲備液的制備 分別精密稱取對照品莨菪堿、東莨菪堿適量，用甲醇溶解并定容到刻度，得質(zhì)量濃度分別為0.351，0.384 mg/mL的混合對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備[6]分別稱取木本曼陀羅不同部位(包括根、莖、葉、花等)粉末約450 mg，精密稱量后置于具塞的錐形瓶中，精準(zhǔn)加入濃氨水-乙醇-乙醚(4∶5∶10)溶液45 mL，搖勻、密塞，室溫放置12 h，常溫下超聲提取2次，每次30 min，用漏斗過濾，收集上清液，殘渣用少許提取液洗滌2次，合并上清液與洗滌液，于60 ℃水浴上旋轉(zhuǎn)蒸干。殘渣用1 mL 濃度0.5 mol/L硫酸溶解(超聲約1 min)，以8 000 r/min離心4 min后，收集上清液至分液漏斗，再用1 mL純水超聲洗滌，同樣轉(zhuǎn)速離心4 min，合并上清液到分液漏斗，用氯仿萃取3次(40，20，20 mL)，每次萃取后棄去氯仿層，水層用0.5 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8～9，再用氯仿萃取3次(40，20，20 mL)，收集合并氯仿層，水浴蒸去氯仿，用甲醇溶解殘渣，超聲1 min，定容至5 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

1.3.3 色譜條件[7]InertSustain C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.07 mol/L磷酸鈉溶液(含0.017 5 mol/L十二烷基硫酸鈉，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.0)(50∶100)，流速1.0 mL/min，檢測波長為216 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL?；旌蠈φ掌啡芤汉蜆悠返湫蜕V圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液(A)和樣品(B)色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixtures reference substances(A)and sample(B)1.東莨菪堿；2.莨菪堿

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系考察

2.2 精密度實驗

精密吸取供試品溶液10 μL，依1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄莨菪堿、東莨菪堿的峰面積，計算RSD值分別為1.87%，1.06%，表明儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性實驗

精密稱取同一樣品粉末5份，按1.3.2節(jié)方法制備供試品溶液，按1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)行測定。計算莨菪堿和東莨菪堿的含量分別為0.036%和0.082%，RSD分別為1.79%和1.23%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性實驗

取同一供試品溶液，分別于制備后的0，5，10，15，20 h進(jìn)樣測定，記錄莨菪堿和東莨菪堿的峰面積，計算RSD值分別為2.28%和1.26%，表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量的白花木本曼陀羅種子粉末3份，每份約410 mg，分別精密加入莨菪堿和東莨菪堿混合對照品溶液適量，按1.3.2節(jié)方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測定并計算莨菪堿和東莨菪堿的加樣回收率及RSD值，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果(n=3)Table 1 Recoveries of hyoscyamine and scopolamine

2.6 樣品含量測定

精密稱取紅、黃、白3種花色木本曼陀羅不同組織部位樣品，按1.3.2節(jié)方法制備供試品溶液，按1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)行測定，利用外標(biāo)法計算莨菪堿和東莨菪堿含量，結(jié)果見表2。

表2 3種花色木本曼陀羅各部位中莨菪堿和東莨菪堿含量Table 2 The contents of hyoscyamine and scopolamine in different parts of 3 colorful Brugmansia Arborea

由表2可知，紅花木本曼陀羅中莨菪堿含量的分布為主根>須根>花苞>嫩葉>花>地下莖>一年生木質(zhì)化莖>多年生木質(zhì)化莖>一年生非木質(zhì)化莖>老葉，主根中含量最高，為0.066%；東莨菪堿含量分布為花苞>花>一年生非木質(zhì)化莖>嫩葉>一年生木質(zhì)化莖>主根>多年生木質(zhì)化莖>老葉>須根>地下莖，花苞中含量最高，為0.114%。

黃花木本曼陀羅中莨菪堿含量分布為嫩葉>須根>花苞>一年生非木質(zhì)化莖>花>多年生木質(zhì)化莖>主根>老葉=一年生木質(zhì)化莖>地下莖，嫩葉中含量最高，為0.156%；東莨菪堿含量分布為嫩葉>一年生非木質(zhì)化莖>花>老葉>多年生木質(zhì)化莖>須根>主根>花苞>一年生木質(zhì)化莖>地下莖，嫩葉中含量最高，為0.287%。

白花木本曼陀羅中莨菪堿含量分布為花苞>主根>一年生木質(zhì)化莖=須根>種子>花>多年生木質(zhì)化莖=地下莖>嫩葉>老葉=一年生非木質(zhì)化莖，花苞中含量最高，為0.058%；東莨菪堿含量分布為一年生木質(zhì)化莖>種子>花>嫩葉>主根>老葉>多年生木質(zhì)化莖=須根>一年生非木質(zhì)化莖>花苞>地下莖，一年生木質(zhì)化莖含量最高，為0.433%。

總體來看，不同花色木本曼陀羅以及各組織部位中莨菪堿和東莨菪堿含量差異較大。紅花木本曼陀羅中東莨菪堿含量總體低于黃花和白花木本曼陀羅，主根和須根中莨菪堿含量略高于東莨菪堿，其他部位以及黃花和白花木本曼陀羅的各部位中東莨菪堿含量都顯著高于莨菪堿含量，而常見的托品烷類生物堿來源植物中莨菪堿含量高于東莨菪堿[8-10]。可見，木本曼陀羅是東莨菪堿優(yōu)勢資源植物。白花木本曼陀羅一年生木質(zhì)化莖中東莨菪堿含量最高，且植株生長量大，可以考慮作為大量提取東莨菪堿的主要原材料，種子中含量也較高，但由于種子的產(chǎn)量受氣候及自身生長影響較大，不適合作為大量工業(yè)生產(chǎn)的原料。由于黃花木本曼陀羅抗性強(qiáng)、生物產(chǎn)量較大，東莨菪堿含量較高，有必要以嫩葉、一年生非木質(zhì)化莖和花作為工業(yè)提取東莨菪堿的原料進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本實驗測定了3種不同花色木本曼陀羅各組織部位中莨菪堿和東莨菪堿含量分布，進(jìn)一步確定了木本曼陀羅是東莨菪堿優(yōu)勢資源植物，更準(zhǔn)確清晰地指導(dǎo)木本曼陀羅的采收部位，為木本曼陀羅作為東莨菪堿資源植物的開發(fā)利用提供了理論參考。