血小板反應素4對肺癌細胞轉(zhuǎn)移及侵襲的影響*

莫正英,王鳳琴,艾淑穎

(湖北省十堰市太和醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院腫瘤科 442000)

隨著檢測水平的提高，越來越多的癌癥被確診。在非傳染性疾病中，癌癥已經(jīng)成為致死率非常高的疾病。其中肺癌在全球的發(fā)病率很高，每年大約有180萬人被診斷為肺癌。肺癌主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中后者占到整個肺癌患者的80%～85%。近年來，腫瘤的治療手段有了很大的進步，有很多新的治療靶點被發(fā)現(xiàn)，但是由于肺癌具有高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，其療效一直不能令人滿意。因此，深入研究其分子機制將極大推動新的、有效的治療手段的應用[1-3]。研究證實，腫瘤微環(huán)境對腫瘤細胞的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學行為有非常大的影響作用。血小板反應素-4(TSP-4)屬于基質(zhì)細胞(ECM)蛋白家族成員，是一種胞外鈣結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)細胞和基質(zhì)之間的反應，在細胞侵襲、轉(zhuǎn)移、黏附和結(jié)合方面發(fā)揮著重要的作用[4-5]?，F(xiàn)有的一些證據(jù)表明，在組織重構(gòu)和生長中，TSP-4可能發(fā)揮了重要作用。并且，在前列腺癌、乳腺癌及消化道腫瘤中發(fā)現(xiàn)，TSP-4在腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移、黏附和附著中也起著重要的作用[4-5]。但是，其在肺癌中是否會導致肺癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲還不是很清楚。本研究研究了TSP-4在肺癌細胞系中的作用，通過加入重組蛋白和siRNA的方法證實了TSP-4能夠促進肺癌細胞的轉(zhuǎn)移和生長并且能夠促進肺癌細胞的侵襲，提示TSP-4可能是治療肺癌的一個潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及試劑 肺癌A549、H292細胞購自中國科學院上海生命科學研究所，培養(yǎng)基為RPMI-1640，含10%胎牛血清(美國Gibco公司)、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素，于37 ℃、5% CO2、95% 濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。重組TSP-4蛋白購自美國Biovision公司。siRNA由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司設計和合成。LipofectamineTM2000 Reagent購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT增殖實驗 將經(jīng)過不同水平TSP-4處理的A549及H292細胞以1.5×105個/毫升單細胞混懸液以100 μL每孔接種于96孔板中，每孔200 μL，每組設5個復孔，沒經(jīng)過蛋白處理的細胞作為對照；將培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，然后每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床振蕩使結(jié)晶物充分溶解；選擇490 nm波長，在酶標儀上檢測各孔吸光度，根據(jù)后面的公式計算細胞增殖率。增殖率=(檢測孔平均A值/對照孔平均A值)×100%。

1.2.2 細胞遷移實驗 A549及H292細胞的遷移能力用 xCELLigence 系統(tǒng)來檢測(美國ACEA Biosciences公司)。 將細胞用含2%血清的DMEM培養(yǎng)基混勻后取200 μL 細胞懸液輕輕加入CIM-16 plate的上室，且上室中加入TSP-4，不加TSP-4的作為對照。在下室中加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。細胞的遷移率通過檢測上下小室的生物電阻來計算。使用xCELLigence RTCA MP 儀器與RTCA軟件1.2進行CI值測定，對細胞持續(xù)監(jiān)測72 h。

1.2.3 細胞侵襲實驗 TSP-4對肺癌細胞的侵襲能力通過3D球體細胞侵襲分析試劑盒檢測。成球和侵襲基質(zhì)成分的準備按照說明書的要求操作。用DMEM和成球基質(zhì)混合細胞，在3D球培養(yǎng)板的每個孔中加入5×102個細胞，在4 ℃條件下，200 g離心3 min。將培養(yǎng)板放入37度孵育72 h，讓球體形成。在加入侵襲基質(zhì)之前，在4 ℃條件下，300 g離心5 min。然后將培養(yǎng)板放入37 ℃，孵育1 h，促進侵襲膠的形成。在孔中加入1 μmol/L的TSP-4,每48 小時記錄成球的圖像。圖像用Image J軟件進行分析。

1.2.4 siRNA干擾 靶向TSP-4基因的特異性siRNA序列為：正義鏈5′-GGC AGU UCU UGG GUC AAA UTT-3′，反義鏈3′-AUU UGA CCC AAG AAC UGC CTT-5′。對照siRNA的序列為：正義鏈5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，反義鏈 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。 合成的siRNA粉末溶解在RNase Free dH2O中，配制成20 mmol/L儲存液分裝保存，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 d，將A549細胞傳代于6孔板中培養(yǎng)，細胞密度應能在24 h內(nèi)使細胞匯合達到70%～90%。按LipofectamineTM2000 Reagent說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6～8 h更換含血清的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.5 Real-time PCR 將實驗分為3組，TSP-4-siRNA 轉(zhuǎn)染組、空siRNA(NC-siRNA)轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組。每組至少3個重復。分別提取各組轉(zhuǎn)染后48 h細胞總RNA，總RNA進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過實時定量PCR擴增目的基因。反應體系為20 μL，其中SYBR Ex Taq 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸20 s，反應40個循環(huán)。采用2-△△Ct法分析目的基因mRNA的相對表達水平。擴增基因的特異性引物序列為：GAPDH：5′-ATC ATC AGC AAT GCC TCC TG-3′(正向)，5′-ATG GAC TGT GGT CAT GAG TC-3′(反向)TSP-4：5′-GTT GCA GAA CCT GGC ATT CAG-3′(正向)，5′-CCC TGG ACC TGT CTT AGA CTT CA-3′(反向)。

1.2.6 Western blot 實驗分組同上，轉(zhuǎn)染48 h后，提取各組蛋白，測定蛋白水平。取各組等量的總蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗、二抗孵育后顯影。所加一抗分別為TSP-4(1∶500)及b-Actin(1∶1 000)。將所得結(jié)果進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 TSP-4對肺癌細胞增殖的影響 在TSP-4水平為10 μmol/L的條件下，對細胞產(chǎn)生了最大的促進作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。并且隨著TSP-4水平的增加，對細胞的促進效率也增加。

2.2 TSP-4對肺癌細胞的遷移能力的影響 在用TSP-4孵育細胞72 h后，在10 μmol/L水平條件下，能顯著增強細胞的遷移(P<0.05)。見圖 2。

A： A549細胞；B:H292細胞

圖1 TSP-4對肺癌細胞增殖的影響

2.3 TSP-4對肺癌細胞侵襲能力的影響 與0 μmol/LTSP-4比較，10 μmol/L的TSP-4顯著增強了細胞的侵襲能力。0 μmol/L TSP-4的細胞第7天細胞球大小沒有明顯變化。而加入10 μmol/L TSP-4的細胞第7天形成的細胞球明顯增大，侵襲性明顯增加。見圖3。

A：A549細胞；B:H292細胞

圖2 TSP-4對肺癌細胞遷移能力的影響

2.4 轉(zhuǎn)染siRNA后A549細胞中TSP-4 mRNA水平和蛋白水平的變化 轉(zhuǎn)染48 h后，分別提取各組A549細胞的RNA進行檢測，驗證其干擾效果，TSP-4-siRNA轉(zhuǎn)染組(0.62±0.09)較NC-siRNA組(1.12±0.04)及未轉(zhuǎn)染組(1.15±0.07)A549細胞中TSP-4 mRNA水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染48 h后，提取各組細胞的蛋白進行Western blot檢測，TSP-4蛋白相對表達強度各組分別為TSP-4-siRNA 轉(zhuǎn)染組0.30±0.05，NC-siRNA 組0.65±0.03，未轉(zhuǎn)染組0.62±0.04；與NC-siRNA組及未轉(zhuǎn)染組比較，TSP-4-siRNA轉(zhuǎn)染組細胞中TSP-4蛋白水平下降。見圖4。

2.5 轉(zhuǎn)染siRNA后A549細胞增殖、遷移和侵襲能力的變化 轉(zhuǎn)染成功后，TSP-4-siRNA轉(zhuǎn)染組對肺癌細胞的促進率(25.30±1.45)%相對未轉(zhuǎn)染組(81.67±3.76)%明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時，轉(zhuǎn)染成功后，TSP-4-siRNA轉(zhuǎn)染組對肺癌細胞的遷移和侵襲能力相對未轉(zhuǎn)染組明顯降低(P<0.01)。見圖5。

A：TSP-4基因蛋白表達水平；B:TSP-4基因mRNA表達水平

圖4轉(zhuǎn)染后各組A549細胞TSP-4蛋白和mRNA的表達

A：增殖影響；B：遷移影響；C:侵襲能力影響

圖5轉(zhuǎn)染siRNA后對A549細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

3 討 論

肺癌在中國是常見的惡性腫瘤，且病死率很高。目前肺癌的治療以手術(shù)切除為主，輔以放化療等其他治療手段，雖然在一定程度上緩解了病情，但總體的療效不滿意，復發(fā)率高，預后差。造成這種結(jié)果的原因是肺癌具有高度的侵襲性，使得肺癌細胞很容易侵襲轉(zhuǎn)移到其他的組織中去。因此，研究肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移機制對指導肺癌的治療有重要意義。

TSPs是一類多功能蛋白質(zhì)家族，參與多種生物學過程的調(diào)控[6]。TSP-1是第1個被發(fā)現(xiàn)的TSPs家族成員，參與抑制肺癌和膀胱癌中的血管生成從而抑制腫瘤生長，但在乳腺癌和胰腺癌中的作用相反[7]。TSP-4是結(jié)構(gòu)上不同于TSP-1的多功能細胞基質(zhì)糖蛋白，其相對分子質(zhì)量為550×103，由每端帶有球型結(jié)構(gòu)域的5個亞基組成，參與調(diào)控關(guān)鍵的細胞生理過程，包括細胞增殖、黏附及侵襲，細胞骨架重構(gòu)，細胞與細胞的相互作用等[8-9]?，F(xiàn)有的研究證實，TSP-4和腫瘤相關(guān)，尤其是在乳腺癌中研究的較多[10-11]；但是這種參與腫瘤發(fā)生的機制了解的并不是很清楚[12]，仍需要很多工作去探究。

TSP-4參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，尤其在一些腫瘤中能夠增強腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲及內(nèi)皮細胞管的形成。LIN等[4]報道，在人的胃癌中，TSP-4的表達和腫瘤大小、TNM分期相關(guān)；MCCART等[5]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌胞外基質(zhì)中，TSP-4的高表達激活基質(zhì)細胞的反應，促進腫瘤細胞的侵襲。但是，TSP-4的表達水平和肺癌的發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系仍然是不清楚的。本研究發(fā)現(xiàn)了TSP-4能促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的能力，表明TSP-4在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用。并且通過siRNA干擾技術(shù)，下調(diào)肺癌細胞中TSP-4的表達，觀察TSP-4水平降低對肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力的影響。結(jié)果顯示，TSP-4表達明顯下降，A549細胞的侵襲、遷移和增殖能力均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明抑制TSP-4表達可明顯降低肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力。

肺癌的侵襲、遷移是涉及多基因改變、多因素參與的復雜生理過程[13]。本研究中的TSP-4可能是參與肺癌侵襲、遷移的調(diào)控因素之一，其他的因素也參與其中。而且，TSP-4是否參與調(diào)節(jié)腫瘤血管生成有待進一步研究證實，且其機制是否與其具有調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移功能，需要進一步研究。因此，TSP-4可能在肺癌發(fā)生和發(fā)展中起重要的作用，但確切的作用及機制還有待更多深入的研究。